PTPN21基因在急性淋巴細(xì)胞白血病的增殖周期和耐藥中的作用和機制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)，是一種以骨髓、外周血和其他器官中未成熟淋巴細(xì)胞的異常增殖為特點的惡性克隆性疾病，成人ALL具有長期預(yù)后差、復(fù)發(fā)后生存率低的特點。在ALL的發(fā)病機制中，遺傳學(xué)改變發(fā)揮了關(guān)鍵作用，探索ALL的遺傳學(xué)特點不僅有助于明確發(fā)病機制，更有助于指導(dǎo)臨床治療。
　　既往研究報道PTKs和PTPs的基因突變或表達量異常導(dǎo)致信號通路分子異常的

2、磷酸化或去磷酸化過程，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖增加、分化異?；虻蛲龈淖儚亩贏LL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PTPN21基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型21，以往報道其在腫瘤組織中高表達并參與腫瘤細(xì)胞的生長，但PTPN21基因是否在ALL中異常高表達尚不明確，PTPN21基因在ALL中發(fā)揮何種作用尚有待研究。
　　本研究通過檢測ALL患者骨髓標(biāo)本發(fā)現(xiàn)PTPN21基因的異常高表達，進一步通過慢病毒感染在ALL的細(xì)胞株中過表達PTPN21基因或

3、利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除PTPN21基因，檢測PTPN21表達量的改變對細(xì)胞的凋亡、增殖周期以及耐藥的影響，并探索相關(guān)機制。
　　第一章 PTPN21基因的過表達在急性淋巴細(xì)胞白血病的增殖周期和耐藥中的作用及機制研究
　　目的:
　　研究PTPN21基因在急性淋巴細(xì)胞白血病中的作用，探索PTPN21是否參與細(xì)胞的增殖周期的調(diào)控和耐藥的發(fā)生，闡明相關(guān)機制。
　　方法:
　　通過熒光定量PCR檢測AL

4、L患者和對照組骨髓標(biāo)本中的PTPN21基因的mRNA水平;慢病毒感染的方法在ALL細(xì)胞株:Jurkat、NALM-6和Reh細(xì)胞中過表達PTPN21基因;Western blotting和免疫熒光鑒定PTPN21蛋白的過表達和檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率;流式細(xì)胞術(shù)檢測ALL細(xì)胞過表達組和對照組的凋亡和增殖周期;Western blotting檢測Src和MAPK通路的磷酸化水平;MAPK通路小分子抑制劑實驗驗證相關(guān)通路的作用;柔紅霉素處理過表達

5、組和對照組細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡來研究ALL細(xì)胞的耐藥;數(shù)字基因表達譜測序篩選差異表達基因，熒光定量PCR驗證，探索耐藥相關(guān)機制。
　　結(jié)果:
　　ALL患者中PTPN21基因的mRNA水平異常增高，并且初診和復(fù)發(fā)的患者中PTPN21基因顯著高表達，而完全緩解的患者PTPN21基因的mRNA水平與對照組無顯著性差異;在Jurkat、NALM-6和Reh細(xì)胞中，過表達PTPN21基因不影響細(xì)胞的凋亡，過表達組的G0期細(xì)胞

6、比例均顯著性低于對照組，而S/G2/M期細(xì)胞比例則顯著性高于對照組，兩組的G1期細(xì)胞比例無顯著性差異，表明PTPN21基因的過表達促進了Jurkat、NALM-6和Reh細(xì)胞的增殖;Jurkat細(xì)胞中過表達組的Src的磷酸化水平明顯減弱，ERK1/2和JNK的磷酸化水平明顯增強，p38的磷酸化水平無明顯變化;NALM-6細(xì)胞過表達組的Src的磷酸化水平明顯減弱，ERK1/2和p38的磷酸化水平明顯增強，JNK的磷酸化水平無顯著性變化;R

7、eh細(xì)胞過表達組的Src的磷酸化水平明顯減弱，ERK1/2、p38和JNK的磷酸化水平均明顯增強;ERK1/2通路抑制劑PD98059并不影響PTPN21的促進ALL細(xì)胞增殖的作用;JNK通路抑制劑SP600125能有效逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進Jurkat細(xì)胞增殖的作用，但不能逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進Reh細(xì)胞增殖的作用;p38通路抑制劑SB203580能有效逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進NALM-6細(xì)胞增殖的作用，并且能部分逆轉(zhuǎn)PTPN21的促進

8、Reh細(xì)胞增殖的作用;PTPN21基因抑制了Jurkat和NALM-6細(xì)胞對柔紅霉素的敏感性;數(shù)字基因表達譜測序初步篩選，熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)IL22RA1基因的mRNA水平上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　PTPN21基因的異常高表達可能參與了ALL的發(fā)病和復(fù)發(fā);PTPN21可能通過去磷酸化Src激活其激酶活性，進一步激活下游MAPK通路，從而促進了ALL細(xì)胞的增殖;參與PTPN21調(diào)控細(xì)胞增殖的MAPK通路可能在不同來源細(xì)胞中通

9、路不同:JNK通路和p38通路可能分別是Jurkat細(xì)胞和NALM-6細(xì)胞中發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路;p38通路可能還部分參與了PTPN21基因促Reh細(xì)胞增殖的作用;PTPN21基因可能參與ALL細(xì)胞對柔紅霉素的耐藥，經(jīng)篩選驗證發(fā)現(xiàn)IL22RA1基因的表達上調(diào)可能參與PTPN21介導(dǎo)的耐藥。
　　第二章應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat中敲除PTPN21基因?qū)υ鲋持芷诘恼{(diào)控作用
　　目的:

10、>　　通過CRISPR-Cas9技術(shù)建立敲除Jurkat細(xì)胞的PTPN21基因的細(xì)胞系，研究敲除PTPN21基因是否抑制ALL細(xì)胞的增殖。
　　方法:
　　選擇Zhanglab MIT的CRISPR Design tool針對2號外顯子和13號外顯子分別進行g(shù)RNA的設(shè)計;以pX458質(zhì)粒作為gRNA的表達載體;以293T細(xì)胞作為目的細(xì)胞，利用T7E1實驗進行不同gRNA的剪切效率檢測;以核轉(zhuǎn)方式在Jurkat細(xì)胞中表達Ca

11、s9質(zhì)粒;流式細(xì)胞分選儀分選GFP表達陽性的細(xì)胞;極限稀釋法進行細(xì)胞單克隆的篩選，提取克隆的基因組DNA，PCR擴增后測序;針對出現(xiàn)雙信號峰的克隆，利用TA克隆進一步測序明確;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測篩選獲得的克隆的凋亡和增殖周期。
　　結(jié)果:
　　通過T7E1實驗選擇分別針對2號外顯子和13號外顯子剪切效率最高的兩條gRNA進行Cas9質(zhì)粒的構(gòu)建;通過測序篩選共獲得5個單等位基因突變和6個雙等位基因突變的克隆，建立了Jurkat