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文檔簡介
1、目的:
擬用薄荷醇作為中藥促進劑的代表,分別從細胞和整體水平探討薄荷醇對丹參素腸吸收的影響,并通過 Caco-2單層細胞模型研究薄荷醇影響丹參素腸吸收與P糖蛋白(P-gp)之間的關(guān)系,探究薄荷醇促進藥物腸吸收的初步機制。
方法:
1.外翻腸囊模型的腸吸收實驗
體外培養(yǎng)建立大鼠外翻腸囊模型,實驗大鼠分組:空白組,維拉帕米陽性對照組,20、40、80μg/mL丹參素組;選擇最佳吸收給藥濃度分別加入體積
2、比:0.1%、0.3%、0.9%薄荷醇組。采用高效液相色譜儀測定不同濃度丹參素的腸吸收情況,并測定了在薄荷醇干預(yù)情況下丹參素腸吸收的程度變化。
2. Caco-2單層細胞模型的建立
取處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞,采用Transwell嵌套板,將吹打后混勻的細胞懸液鋪于上層膜上培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液。觀察細胞形態(tài),并利用電阻測定儀檢測細胞間跨膜電阻作為單層細胞模型建立成功的依據(jù)。
3.MTT藥物濃度毒性實
3、驗
采用MTT法,用CCK-8試劑盒對Caco-2細胞模型進行藥物毒性實驗,使用酶標(biāo)儀測定OD值,計算細胞存活率并確定藥物給藥濃度。
4.Caco-2單層模型的細胞轉(zhuǎn)運實驗
體外培養(yǎng)建立 Caco-2單層細胞模型,實驗細胞分組:空白組,維拉帕米陽性對照組,10、20、40、60μM丹參素組;選擇吸收較好的兩組加入:2、8、16μM(低、中、高)薄荷醇組。采用高效液相色譜儀測定不同濃度丹參素轉(zhuǎn)運后的藥物濃度,
4、并測定在薄荷醇影響下丹參素轉(zhuǎn)運濃度的變化。
5.細胞底物積累和外排實驗
體外培養(yǎng)建立 Caco-2單層細胞模型,實驗細胞分為:空白組,維拉帕米陽性對照組,40μM丹參素組,2、8、16μM(低劑量組、中劑量組和高劑量組)薄荷醇組以及丹參素-薄荷醇混合溶液組和丹參素-維拉帕米混合溶液組。采用多功能酶標(biāo)儀測定了熒光強度和總蛋白含量,結(jié)果用熒光強度/mgpro表示,可以間接反映Rh123在Caco-2細胞里的含量。
5、 結(jié)果:
1.翻腸囊模型腸吸收試驗
外翻腸囊模型腸吸收實驗結(jié)果顯示,丹參素在40μg/mL的給藥濃度下累積吸收量最好,為最佳濃度。在加入0.1%薄荷醇之后,吸收速率和累積吸收量明顯上升;在加入0.9%薄荷醇之后,吸收速率反而下降,累積吸收量無明顯變化。
2. Caco-2細胞模型的驗證
Caco-2細胞在培養(yǎng)過程中融合度變高,電阻值也逐漸升高,直至21天左右形成致密的單層細胞膜,測定細胞間跨膜電
6、阻值大于400Ω/cm2。
3.丹參素、薄荷醇和維拉帕米給藥濃度的確定
細胞藥物毒性實驗顯示,丹參素在給藥濃度不高于50μM時,Caco-2細胞存活率>90%;薄荷醇在給藥濃度不高于16μM時,Caco-2細胞存活率>90%,維拉帕米在給藥濃度不高于30μM時,Caco-2細胞存活率>90%,以此作為丹參素、薄荷醇和維拉帕米的敏感給藥濃度。丹參素和薄荷醇混合溶液在丹參素給藥濃度低于50μM、薄荷醇給藥濃度低于16μM
7、時,Caco-2細胞存活率>90%;丹參素和維拉帕米混合溶液在丹參素給藥濃度低于40μM、維拉帕米給藥濃度低于30μM時,Caco-2細胞存活率>90%。
4. Caco-2單層細胞模型轉(zhuǎn)運實驗
細胞轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果顯示,丹參素在35μM、40μM給藥濃度下滲透系數(shù)好,吸收程度較好。薄荷醇在給藥濃度為2μM時,丹參素的滲透系數(shù)明顯提升,轉(zhuǎn)運率明顯升高;在給藥濃度為16μM時,丹參素的滲透系數(shù)沒有明顯變化,轉(zhuǎn)運率有下降趨勢
8、;丹參素的轉(zhuǎn)運速率隨著維拉帕米給藥濃度的升高而上升,成濃度依賴性。
5.薄荷醇對丹參素腸吸收的影響和P-gp的關(guān)系
細胞累積實驗結(jié)果顯示,Caco-2細胞中 Rh123的累積量不隨著薄荷醇給藥濃度而改變,在低濃度時明顯高于空白組(只有丹參素)(P<0.05),在高濃度時則無明顯變化(P>0.05);細胞外排實驗結(jié)果顯示,薄荷醇組Caco-2細胞中Rh123的外排量在低濃度時明顯增加(P<0.05),高濃度時反而無明顯
9、變化(P>0.05)。
結(jié)論:
1.低濃度的薄荷醇可以促進丹參素的腸吸收,而高濃度的薄荷醇可能對丹參素腸吸收有抑制作用;
2.低濃度的薄荷醇可以增強Caco-2細胞對P-gp底物的積累,減少外排;高濃度的薄荷醇則對Caco-2細胞對P-gp底物的積累和外排無明顯影響;
3.薄荷醇影響丹參素的腸吸收機制與 P-gp表達有著密切關(guān)聯(lián),低濃度的薄荷醇有可能抑制Caco-2細胞內(nèi)P-gp表達從而促進丹參素
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