薄荷醇的促透作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的： 確定薄荷醇與氮酮聯(lián)合應(yīng)用對5-Fu的促透效果；探討薄荷醇的經(jīng)皮促透作用機(jī)制。 方法： 1、薄荷醇與氮酮聯(lián)用促透效果的評價(jià) 采用兩室擴(kuò)散池體外實(shí)驗(yàn)裝置，選取大鼠背部皮膚，以5-Fu作為模型藥物，計(jì)算出其穩(wěn)態(tài)流量及滲透系數(shù)，采用倍量法探討不同濃度的薄荷醇與氮酮聯(lián)用后的促透效果。 2、薄荷醇對皮膚微觀結(jié)構(gòu)的影響 2.1光鏡下觀測皮膚的結(jié)構(gòu)變化 大鼠背部脫毛后，自然恢復(fù)一天，在體給

2、藥8h后處死，取用藥部位皮膚，10％的甲醛溶液固定24h，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀測皮膚角質(zhì)層及角質(zhì)細(xì)胞間隙的變化。 2.2掃描電鏡觀測皮膚結(jié)構(gòu)的變化 大鼠背部脫毛后，自然恢復(fù)一天，在體給藥8h后處死，取用藥部位皮膚，2.5％戊二醛固定24h，4℃磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中清洗，酒精梯度脫水，丙酮置換，最后放入中間液醋酸異戊酯中置換，CO2臨界點(diǎn)干燥，粘樣，離子濺射鍍膜，掃描電鏡觀察皮膚表面結(jié)構(gòu)

3、及角質(zhì)層間隙的變化。 2.3透射電鏡觀測皮膚結(jié)構(gòu)的變化 大鼠背部脫毛后，自然恢復(fù)一天，在體給藥8h后處死，取用藥部位皮膚，2.5％戊二醛固定，4℃磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中清洗，1％鋨酸后固定，系列丙酮脫水，環(huán)氧樹脂滲透與定向包埋，超薄切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀測皮膚角質(zhì)層及皮膚間連接的變化。 3、ATR-FTIR研究薄荷醇對皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響 選用大鼠皮膚，脫毛后，自然恢復(fù)一天，處死大鼠，

4、取用皮膚，制備角質(zhì)層，角質(zhì)層放入薄荷醇溶液中37℃作用24h，取出角質(zhì)層完全干燥，采用ATR-FTIR測定皮膚脂質(zhì)的紅外光譜。采用在人體皮膚給藥8h后，清洗干凈用藥部位，直接測定用藥部位的皮膚紅外光譜。根據(jù)紅外光譜圖中脂質(zhì)類物質(zhì)的CH的振動位移的變化，探討薄荷醇作用后，皮膚中脂質(zhì)類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象的變化，以確定薄荷醇對皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的影響。 4、薄荷醇對KC內(nèi)Ca2+及Ca2+-ATP酶活性的影響 4.1薄荷醇對KC內(nèi)C

5、a2+的影響 采用人KC無血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，待90％以上細(xì)胞貼壁后，加入含有不同濃度的薄荷醇的培養(yǎng)基，利用流式細(xì)胞儀（FCM）結(jié)合Fluo－3/AM染色技術(shù)，半定量測定檢測不同濃度薄荷醇與氮酮對KC內(nèi)Ca2＋濃度的影響。 4.2薄荷醇對KC內(nèi)Ca2+-ATP酶活性的影響 采用無血清完全培養(yǎng)基原代培養(yǎng)人KC，待90％以上的細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)30min后，離心，棄去上清液，加入一定

6、量的生理鹽水，急速冷凍解凍法破碎細(xì)胞，超微量Ca2+-ATP酶試劑盒，測定KC內(nèi)Ca2+-ATP酶活性。 結(jié)果： 1、薄荷醇與氮酮聯(lián)用促透效果的評價(jià) 研究發(fā)現(xiàn)薄荷醇在250mg/mL濃度時(shí)與氮酮在250μl/mL濃度時(shí)聯(lián)用具有一定的協(xié)同作用，但在薄荷醇濃度≥ 500mg/mL與氮酮在濃度≥ 500μl/mL時(shí)聯(lián)用并沒有顯示出協(xié)同作用。 2、薄荷醇對皮膚微觀結(jié)構(gòu)的影響 2.1 光鏡下觀測結(jié)果

7、 與空白組、溶劑組相比，薄荷醇組角質(zhì)層疏松、脫落現(xiàn)象明顯，薄荷醇組一些區(qū)域外層角質(zhì)呈帶狀游離分布；角質(zhì)細(xì)胞間隙變大；可知薄荷醇改變了皮膚角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)，使角質(zhì)層結(jié)構(gòu)變的疏松、細(xì)胞間隙變大，從而降低了皮膚的屏障作用。 2.2 掃面電鏡觀測結(jié)果 與空白組和溶劑組相比，薄荷醇作用后的表皮皺多折明顯增，角質(zhì)層脫落較明顯，角質(zhì)層明顯疏松可見有孔穴樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn),表皮間裂隙增寬;薄荷醇組皮膚縱切面觀測：表皮角質(zhì)層結(jié)構(gòu)明顯松動，最外層角質(zhì)層

8、脫落明顯，各層之間出現(xiàn)明顯的間隙，表皮與真皮分離。薄荷醇影響了表皮結(jié)構(gòu)，使表皮變得疏松，角質(zhì)層有序致密結(jié)構(gòu)破壞，降低了皮膚的屏障作用，使皮膚的通透性增加。 2.3 透射電鏡觀測結(jié)果 與空白組和溶劑組相比，薄荷醇使角質(zhì)層排列紊亂，層與層間的間隙變得更大，脂質(zhì)正常的板層狀膜狀結(jié)構(gòu)大部或全部消失，出現(xiàn)明顯增厚的紊亂排列的中等致密的凝絮塊狀結(jié)構(gòu)。各組角質(zhì)層細(xì)胞間的連接無顯著性差異；薄荷醇擾亂了角質(zhì)層的有序排列，使角質(zhì)層之間的空隙

9、變大，結(jié)構(gòu)疏松，皮膚通透性增加。 3、ATR-FTIR研究薄荷醇對皮膚結(jié)構(gòu)的影響 經(jīng)薄荷醇處理的人及大鼠表皮角質(zhì)層中的脂質(zhì)的CH2伸縮振動峰與正常組及溶劑組比較峰位向高峰位移動了3-4個(gè)波長，表明脂質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了改變，角質(zhì)層中脂質(zhì)排列的無序性增加。 4、薄荷醇對KC內(nèi)Ca2+及Ca2+-ATP酶活性的影響 4.1 對KC內(nèi)Ca2+的影響 與空白組相比，不同濃度的薄荷醇作用的KC內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度

10、發(fā)生了右移，熒光強(qiáng)度增加；與溶劑組相比，薄荷醇組從25.00μmol/L開始對可顯著增加KC內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度（p<0.01），25.00μmol/L的薄荷醇與50.00μmol/L的薄荷醇組熒光強(qiáng)度無顯著性差異(p>0.05);100μmol/L的薄荷醇與其他組相比有顯著性差異（p<0.01）；200μmol/L、400μmol/L的薄荷醇組無顯著性差異(p>0.05)；細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度的改變不存在濃度依賴性。 4.

11、2 對KC內(nèi)Ca2+-ATP酶活性的影響 與空白組相比，溶劑組及不同濃度的薄荷醇均降低了Ca2+-ATP酶的活性，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異（P<0.01），表明0.1％DMSO及不同濃度的薄荷醇對Ca2+-ATP酶活性有不同程度的影響；與溶劑組相比，薄荷醇從25.00μmol/L到400μmol/L濃度對Ca2+-ATP酶活性有顯著性差異（P<0.01，P<0.05）。 結(jié)論： 1、薄荷醇在250mg/mL濃度時(shí)

12、與氮酮在250μl/mL濃度時(shí)聯(lián)用具有一定的協(xié)同作用，但在薄荷醇濃度≥ 500mg/mL與氮酮在濃度≥ 500μl/mL時(shí)聯(lián)用并沒有顯示出協(xié)同作用。 2、薄荷醇對皮膚微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，使表皮皺折明顯增多，角質(zhì)層排列紊亂，表皮間裂隙增寬，層與層間的間隙變得更大，角質(zhì)層變的疏松，從表皮脫落.可知薄荷醇改變了角質(zhì)層的有序致密結(jié)構(gòu)，使表皮變得疏松，皮膚通透性增加。 3、薄荷醇改變了人及大鼠表皮角質(zhì)層中的脂質(zhì)的構(gòu)象，使表皮角質(zhì)層