薄荷醇的皮膚毒性作用及其機制研究.pdf

1、目的：觀察薄荷醇的皮膚刺激性和致敏性；通過體外角質(zhì)形成細胞(KC)培養(yǎng)法測定不同濃度薄荷醇對角質(zhì)形成細胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率的影響，并通過電鏡掃描了解不同濃度薄荷醇作用下細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，研究薄荷醇對角質(zhì)形成細胞的毒性反應；采用流式細胞儀檢測不同濃度薄荷醇對角質(zhì)形成細胞細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響來推測其發(fā)生機制。依據(jù)上述實驗結(jié)果對薄荷醇皮肽安全性進行評價。 方法：1薄荷醇皮膚刺激性試驗 1.1急性皮膚刺激性試驗

2、 家兔隨機分為完整皮膚組和破損皮膚組，實驗開始前24h脫毛并用消毒的針頭在家兔背部皮膚作劃痕致滲血，制作破損皮膚模型。采用同體左右側(cè)自身對比法，在家兔背部皮膚上均勻涂抹薄荷醇乙醇溶液，并于去除藥物后1h、24h、48h、72h進行觀察紅斑和紅腫等情況，試驗結(jié)束后取各組皮膚進行HE染色觀察皮膚結(jié)構(gòu)改變。 1.2多次給藥皮膚刺激性試驗 實驗方法同急性皮膚刺激性試驗。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天，每天觀察給藥部位紅斑、水腫情

3、況。并于給藥結(jié)束后1h、24h、48h、72h進行連續(xù)觀察，了解皮膚變化情況。試驗結(jié)束后取各組皮膚進行HE染色觀察受試部位皮膚結(jié)構(gòu)變化。 2薄荷醇皮膚過敏試驗 選取健康豚鼠分組，在其背部皮膚脊柱兩側(cè)選取面積為3×3cm2的皮膚，剃毛。于1d、7d、14d重復接觸薄荷醇乙醇溶液，重復接觸后14d進行激發(fā)接觸，在激發(fā)接觸后6h、24h、48h、72h后觀察皮膚過敏反應情況。 3薄荷醇對人角質(zhì)形成細胞的影響 3

4、.1LDH釋放率測定 將人角質(zhì)形成細胞以2.0×105/m1接種于預鋪多聚賴氨酸的24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)4d后，加入薄荷醇使終濃度呈系列濃度，其中用0.1％二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對照，新鮮DMEM完全培養(yǎng)基作為空白對照。薄荷醇作用24h后按說明書進行操作，檢測細胞內(nèi)LDH釋放率。 3.2薄荷醇對角質(zhì)形成細胞形態(tài)的影響 取不同濃度薄荷醇作用于KC細胞，24h后收集細胞，細胞沉淀，離心，棄上清夜，各組加預冷的體積分

5、數(shù)為2.5％戊二醛4ml固定2h后，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，梯度酒精依次脫水后制備掃描電鏡樣本。掃描電鏡觀察角質(zhì)形成細胞表面形態(tài)的改變。 3.3不同濃度薄荷醇對角質(zhì)形成細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響 利用流式細胞儀(FCM)結(jié)合Fluo-3/AM染色技術(shù)，半定量檢測不同濃度薄荷醇對角質(zhì)形成細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。 結(jié)論：1.薄荷醇對家兔皮膚無急性刺激性。在臨床常用濃度(1％)下，薄荷醇多次給藥對家兔皮膚沒有刺激性；但在

6、2％濃度以上的薄荷醇在多次給藥后會引起家兔皮膚結(jié)構(gòu)不同程度的改變。薄荷醇對豚鼠皮膚無致敏性。 2.薄荷醇在950μmol/L濃度時，角質(zhì)形成細胞LDH釋放率增加明顯；同時，電鏡掃描結(jié)果顯示在該濃度下角質(zhì)形成細胞變形較多。而其他各組LDH釋放率較低，未見變形的角質(zhì)形成細胞。實驗結(jié)果提示薄荷醇對角質(zhì)形成細胞損傷程度很低，但為什么在950μmol/L濃度時損傷程度較高、細胞變形較多，其原因有待于進一步研究。 3.除450μmo