薄荷醇的皮膚毒性作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察薄荷醇的皮膚刺激性和致敏性；通過體外角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)培養(yǎng)法測(cè)定不同濃度薄荷醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放率的影響，并通過電鏡掃描了解不同濃度薄荷醇作用下細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，研究薄荷醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的毒性反應(yīng)；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度薄荷醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響來推測(cè)其發(fā)生機(jī)制。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)薄荷醇皮肽安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法：1薄荷醇皮膚刺激性試驗(yàn) 1.1急性皮膚刺激性試驗(yàn)

2、 家兔隨機(jī)分為完整皮膚組和破損皮膚組，實(shí)驗(yàn)開始前24h脫毛并用消毒的針頭在家兔背部皮膚作劃痕致滲血，制作破損皮膚模型。采用同體左右側(cè)自身對(duì)比法，在家兔背部皮膚上均勻涂抹薄荷醇乙醇溶液，并于去除藥物后1h、24h、48h、72h進(jìn)行觀察紅斑和紅腫等情況，試驗(yàn)結(jié)束后取各組皮膚進(jìn)行HE染色觀察皮膚結(jié)構(gòu)改變。 1.2多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法同急性皮膚刺激性試驗(yàn)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天，每天觀察給藥部位紅斑、水腫情

3、況。并于給藥結(jié)束后1h、24h、48h、72h進(jìn)行連續(xù)觀察，了解皮膚變化情況。試驗(yàn)結(jié)束后取各組皮膚進(jìn)行HE染色觀察受試部位皮膚結(jié)構(gòu)變化。 2薄荷醇皮膚過敏試驗(yàn) 選取健康豚鼠分組，在其背部皮膚脊柱兩側(cè)選取面積為3×3cm2的皮膚，剃毛。于1d、7d、14d重復(fù)接觸薄荷醇乙醇溶液，重復(fù)接觸后14d進(jìn)行激發(fā)接觸，在激發(fā)接觸后6h、24h、48h、72h后觀察皮膚過敏反應(yīng)情況。 3薄荷醇對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞的影響 3

4、.1LDH釋放率測(cè)定 將人角質(zhì)形成細(xì)胞以2.0×105/m1接種于預(yù)鋪多聚賴氨酸的24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)4d后，加入薄荷醇使終濃度呈系列濃度，其中用0.1％二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對(duì)照，新鮮DMEM完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。薄荷醇作用24h后按說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LDH釋放率。 3.2薄荷醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞形態(tài)的影響 取不同濃度薄荷醇作用于KC細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀，離心，棄上清夜，各組加預(yù)冷的體積分

5、數(shù)為2.5％戊二醛4ml固定2h后，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，梯度酒精依次脫水后制備掃描電鏡樣本。掃描電鏡觀察角質(zhì)形成細(xì)胞表面形態(tài)的改變。 3.3不同濃度薄荷醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響 利用流式細(xì)胞儀(FCM)結(jié)合Fluo-3/AM染色技術(shù)，半定量檢測(cè)不同濃度薄荷醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。 結(jié)論：1.薄荷醇對(duì)家兔皮膚無急性刺激性。在臨床常用濃度(1％)下，薄荷醇多次給藥對(duì)家兔皮膚沒有刺激性；但在

6、2％濃度以上的薄荷醇在多次給藥后會(huì)引起家兔皮膚結(jié)構(gòu)不同程度的改變。薄荷醇對(duì)豚鼠皮膚無致敏性。 2.薄荷醇在950μmol/L濃度時(shí)，角質(zhì)形成細(xì)胞LDH釋放率增加明顯；同時(shí)，電鏡掃描結(jié)果顯示在該濃度下角質(zhì)形成細(xì)胞變形較多。而其他各組LDH釋放率較低，未見變形的角質(zhì)形成細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示薄荷醇對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞損傷程度很低，但為什么在950μmol/L濃度時(shí)損傷程度較高、細(xì)胞變形較多，其原因有待于進(jìn)一步研究。 3.除450μmo