脂多糖預(yù)處理對脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞抗凋亡的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:脂多糖預(yù)處理對大鼠脊髓損傷修復(fù)作用的實驗研究
　　目的:本實驗分別采用改良Allen’s及NYU重物打擊法復(fù)制大鼠創(chuàng)傷性脊髓損傷模型，通過低劑量LPS預(yù)處理誘導(dǎo)免疫交叉耐受，觀察LPS預(yù)處理對脊髓損傷的抗凋亡及功能康復(fù)作用，進(jìn)一步研究LPS預(yù)處理對轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)的影響，為LPS誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫耐受提供新的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)，同時為脊髓損傷提供一種新的預(yù)防和治療靶點。
　　方法:(1)132只成年健康SD大

2、鼠被隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(n=12)、模型組(n=60)及LPS預(yù)處理組(n=60)。采用改良Allen's打擊法制作急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）模型，在術(shù)后1、3、5、7d進(jìn)行BBB評分;在建模后6、12h、1、3、5、7d獲取損傷段脊髓標(biāo)本，HE染色觀察其組織病理學(xué)變化，Nissl染色觀察神經(jīng)元中尼氏小體的變化，免疫組織化學(xué)染色(IHC)定位觀察損傷段脊髓中Nrf2及caspase-3

3、的表達(dá)變化規(guī)律，Western blotting法分析損傷段脊髓中Nrf2表達(dá)變化規(guī)律。(2)72只成年健康SD雌性大鼠被隨機(jī)分為4組（n=18/組）:假手術(shù)組、對照組、LPS預(yù)處理組及甲強(qiáng)龍組。采用標(biāo)準(zhǔn)化NYU打擊法(New York University impactor)制作創(chuàng)傷性脊髓損傷模型，各組在術(shù)后6、12、24、48、72h進(jìn)行BBB評分;在建模后72 h獲取損傷段脊髓標(biāo)本，HE及Nissl染色觀察損傷組織神經(jīng)病理學(xué)變化，

4、透射電鏡及TUNEL法檢測脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化，免疫組化染色定位觀察損傷段脊髓中Nrf2、caspase-3、Bax及Bcl-2的表達(dá)變化，Western blotting法分析損傷段脊髓中Nrf2、caspase-3、cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)模型組和預(yù)處理組術(shù)后1、3d大鼠BBB評分都有明顯降低，5、7d時預(yù)處理組BBB評分明顯高于模型組(P＜0.05);6、12

5、、24 h時HE和Nissl染色顯示模型組和預(yù)處理組脊髓有廣泛性出血，大量紅細(xì)胞滲出，間質(zhì)水腫嚴(yán)重，核固縮，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞體積變小，尼氏體模糊、碎裂。假手術(shù)組大鼠脊髓組織低表達(dá)Nrf2及微量表達(dá)caspase-3;1、3、5和7d時，與模型組相比，預(yù)處理組形態(tài)學(xué)損傷明顯減輕，Nrf2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01，P＜0.05)，caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)。(2)與對照組相比，24、48

6、、72h預(yù)處理組BBB評分顯著提高(P＜0.05);而預(yù)處理組與甲強(qiáng)龍組相比，兩組各時間點BBB評分無統(tǒng)計學(xué)差異。與對照組和甲強(qiáng)龍組相比，損傷后72 h預(yù)處理組損傷段脊髓的形態(tài)學(xué)變化明顯改善，同時透射電鏡及TUNEL染色顯示預(yù)處理組損傷脊髓組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著降低(P＜0.01)。IHC和Western blotting分析顯示:與對照組和甲強(qiáng)龍組相比，損傷后72 h預(yù)處理組損傷脊髓組織中凋亡蛋白caspase-3、cleaved c

7、aspase-3及Bax的表達(dá)明顯降低，而轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)顯著升高。
　　結(jié)論:低劑量LPS預(yù)處理具有抑制脊髓損傷組織中炎細(xì)胞集聚、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生及神經(jīng)元凋亡的生物學(xué)效應(yīng)，這可能是其促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制之一。低劑量LPS預(yù)處理能夠?qū)?chuàng)傷性脊髓損傷發(fā)揮保護(hù)作用，且該作用與其激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，調(diào)控凋亡相關(guān)因子caspase-3、cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2

8、的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，這可能是LPS誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)耐受性保護(hù)的又一相關(guān)機(jī)制。
　　第二部分:大鼠脊髓組織siRNA轉(zhuǎn)染及ERK、Nrf2基因沉默效果評價
　　目的:檢測局部椎管內(nèi)注射法轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入大鼠脊髓組織的轉(zhuǎn)染效果，并應(yīng)用RT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測大鼠局部脊髓組織中ERK及Nrf2蛋白分別進(jìn)行RNA干擾后的沉默效果，為后續(xù)實驗提供材料。
　　方法:成年健康雌性SD大鼠在實

9、驗動物中心飼養(yǎng)3天后，使用微量注射器將含熒光慢病毒載體的稀釋液注射入脊髓T10水平背側(cè)深約0.8 mm，通過熒光顯微鏡觀察不同時間點的轉(zhuǎn)染效果。分別轉(zhuǎn)染ERK及Nrf2的siRNA進(jìn)入大鼠局部脊髓組織，轉(zhuǎn)染后7d應(yīng)用RT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測RNA干擾后ERK及Nrf2基因的mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與假手術(shù)組相比，模型組在慢病毒轉(zhuǎn)染后各時間點脊髓組織中均有較強(qiáng)的熒光表達(dá)，且在3d和7d時慢病

10、毒轉(zhuǎn)染效果較明顯。模型組在熒光慢病毒轉(zhuǎn)染后，脊髓組織中熒光表達(dá)具有時間依賴性，且在轉(zhuǎn)染后7d達(dá)到高峰。RT-PCR技術(shù)分別檢測大鼠脊髓組織中ERK及Nrf2基因沉默效果顯示，轉(zhuǎn)染后7d假手術(shù)組與模型組中ERK基因mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)，同樣在兩組中Nrf2基因mRNA的表達(dá)也較轉(zhuǎn)染前明顯減少(P＜0.01)。Westernblotting技術(shù)分別檢測大鼠脊髓組織中ERK及Nrf2基因沉默效果顯示，轉(zhuǎn)

11、染后7d假手術(shù)組與模型組中ERK蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)，同樣在兩組中Nrf2蛋白表達(dá)也較轉(zhuǎn)染前顯著減少(P＜0.01)。
　　結(jié)論:局部椎管內(nèi)注射法能夠轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入在體大鼠脊髓組織，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)能夠有效沉默ERK及Nrf2基因的表達(dá)。
　　第三部分:脂多糖預(yù)處理對脊髓損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞抗凋亡作用的機(jī)制研究
　　目的:探討脂多糖預(yù)處理對脊髓損傷神經(jīng)細(xì)胞抗凋亡作用的分子機(jī)制及靶點，

12、為后期臨床實踐及藥物治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:(1)48只成年健康SD雌性大鼠，隨機(jī)分為4組(n=12/組)。a:對照載體組;b:LPS+對照載體組;c:ERK1/2干擾組;d:LPS+ERK1/2干擾組。采用標(biāo)準(zhǔn)化NYU打擊法制作創(chuàng)傷性脊髓損傷模型，各組大鼠在術(shù)后72 h安樂死后獲取損傷段脊髓標(biāo)本，透射電鏡觀察神經(jīng)元凋亡形態(tài)，TUNEL法觀察脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化，免疫組織化學(xué)染色定位觀察損傷段脊髓中Nrf2、HO-1、

13、NQO1及GCLC的表達(dá)及分布情況，Western blotting技術(shù)檢測損傷段脊髓中總Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC蛋白的表達(dá)變化，同時Western blotting技術(shù)檢測損傷段脊髓中胞漿及胞核Nrf2蛋白表達(dá)變化。(2)48只成年健康SD雌性大鼠，隨機(jī)分為4組(n=12/組)。e:對照載體組;f: LPS+對照載體組;g:Nrf2干擾組;h:LPS+Nrf2干擾組。采用標(biāo)準(zhǔn)化NYU打擊法制作創(chuàng)傷性脊髓損傷模型，各組大鼠

14、在術(shù)后72 h安樂死后獲取損傷段脊髓標(biāo)本，透射電鏡觀察神經(jīng)元凋亡形態(tài)，TUNEL法觀察脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡變化，免疫組織化學(xué)染色定位觀察損傷段脊髓中HO-1、NQO1及GCLC蛋白的表達(dá)及分布情況，Western blotting技術(shù)檢測損傷段脊髓中HO-1、NQO1及GCLC蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)透射電鏡觀察顯示a、c兩組損傷段脊髓組織中均有大量形態(tài)異常的凋亡神經(jīng)細(xì)胞，出現(xiàn)神經(jīng)元萎縮，胞質(zhì)空泡化，染色質(zhì)邊集及核膜連

15、續(xù)性中斷等變化;而b組中神經(jīng)元顯示更少的形態(tài)異常及清晰的核膜結(jié)構(gòu)。TUNEL染色顯示與a及d組相比，b組脊髓組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降(P＜0.01)。與d組相比，免疫組織化學(xué)染色顯示b組脊髓組織中Nrf2、HO-1及NQO1陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.01)，但兩組間GCLC陽性細(xì)胞數(shù)未見明顯差異;與a組相比，b組中Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)。Western blo

16、tting分析顯示b組損傷段脊髓中胞漿Nrf2、胞核Nrf2、總Nrf2、HO-1及NQO1蛋白表達(dá)均較d組明顯升高(P＜0.01)，但GCLC蛋白表達(dá)在兩組間無顯著差異;而與a組相比，b組上述蛋白表達(dá)均顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)。(2)透射電鏡及TUNEL染色顯示e、g、h三組損傷段脊髓組織中有大量凋亡神經(jīng)細(xì)胞，而f組脊髓組織中凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P＜0.01)，且神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)較完整。免疫組織化學(xué)染色顯示與e及

17、h組相比，f組脊髓組織中HO-1、NQO1及GCLC陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P＜0.01)。Western blotting分析顯示f組損傷段脊髓中HO-1、NQO1及GCLC蛋白表達(dá)均較e、h兩組明顯升高(P＜0.01);與e組相比，Nrf2基因沉默后g組HO-1及NQO1蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)。
　　結(jié)論:低劑量脂多糖預(yù)處理可激活絲裂酶原途徑中的ERK1/2分子，通過ERK1/2-Nrf2/ARE通路有效