新清開靈干預(yù)大鼠腦出血后炎癥反應(yīng)抑制繼發(fā)性腦損傷的機制研究.pdf

1、腦出血是腦血管病危急重癥之一，以其高發(fā)病率、死亡率和致殘率已成為當(dāng)代嚴重危及人類生命和健康的第三大疾病。腦出血后引起機體和腦組織局部一系列病理生理改變，其病理生理機制涉及多個環(huán)節(jié)，小膠質(zhì)細胞活化、炎癥反應(yīng)、自由基的損傷等在腦出血后所產(chǎn)生的繼發(fā)性損傷中皆起重要的作用。對腦出血后遲發(fā)性腦損傷機制的深入研究，可為臨床用藥提供直接而確切的依據(jù)。 中藥制劑清開靈注射液為治療腦血管疾病的常用制劑，但是在長期臨床應(yīng)用中出現(xiàn)諸多不良反應(yīng)。為了尋

2、求更安全可靠的的新藥，特對清開靈注射液進行了二次開發(fā)，成為新清開靈注射液(簡稱新清開靈)。本實驗探討新清開靈通過干預(yù)大鼠實驗性腦出血急性期小膠質(zhì)細胞的活化，從而阻斷炎癥反應(yīng)和減輕自由基損傷的作用機制。 研究內(nèi)容包括文獻綜述和實驗研究兩個部分。文獻綜述部分討論了小膠質(zhì)細胞活化及細胞因子與腦出血的關(guān)系，中醫(yī)藥治療出血性腦血管疾病的研究概況以及清開靈注射液治療腦出血的研究進展。實驗研究部分采用大鼠尾狀核注射膠原酶制造腦出血模型，研究新

3、清開靈對腦出血后小膠質(zhì)細胞活化程度，細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和β2-整合素(Mac-1)的表達，白細胞介素-8(IL-8)和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，以及髓過氧化物酶(MPO)和超氧化物岐化酶(SOD)活性的影響。實驗研究結(jié)果如下： 1.新清開靈改善出血性腦損傷的病理學(xué)觀察 正常組腦組織結(jié)構(gòu)清晰，皮層神經(jīng)細胞排列整齊。神經(jīng)元胞漿豐富，淡染；胞核居中，核仁清楚。小膠質(zhì)細胞數(shù)目較少，其形態(tài)呈分支狀或桿狀。

4、血管內(nèi)皮細胞完整、連接緊密，未見細胞黏附及嵌塞，血管周圍組織致密。腦實質(zhì)內(nèi)未見炎細胞浸潤。 出血48小時和7天模型組可見損傷側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元缺失，密度降低，間質(zhì)疏松呈水腫樣。神經(jīng)細胞胞漿濃縮紅染，胞核皺縮。膠質(zhì)細胞數(shù)目增多，胞體肥大。血管周圍間隙增大，炎性細胞聚集于血管周圍，內(nèi)皮細胞受損，偶見血管內(nèi)多形核白細胞黏附和嵌塞。腦組織內(nèi)可見散在淋巴細胞浸潤。各給藥組大鼠腦組織血腫范圍和炎性細胞浸潤明顯減小，細胞腫脹減輕。尤以出

5、血后7天的治療組作用較顯著。 2.新清開靈對腦出血后小膠質(zhì)細胞活化的影響 小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)病理事件的傳感器，在CNS損傷中具有獨特的破壞作用，其過度活化是腦出血后神經(jīng)元遲發(fā)性損傷的主要因素。實驗采用凝集素RCA-1標記的組化方法觀察活化的小膠質(zhì)細胞。結(jié)果顯示，正常組腦組織僅有少量小膠質(zhì)細胞表達。出血48小時模型組活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)目顯著增多，陽性細胞呈圓形、卵圓形，胞體肥大增生，有的呈阿米巴狀。出血后7

6、天仍有大量的小膠質(zhì)細胞表達。新清開靈干預(yù)組顯著降低了小膠質(zhì)細胞的活化程度?？梢娔X出血后，新清開靈可能通過抑制小膠質(zhì)細胞的活化而起到大腦保護作用。 3.新清開靈對腦出血后炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用 腦出后腦組織局部過度的炎癥反應(yīng)促進了繼發(fā)性腦損害的發(fā)展，其組織學(xué)特征是白細胞浸潤。白細胞轉(zhuǎn)化為病源性細胞之前，必須和血管內(nèi)皮緊密結(jié)合，而這種結(jié)合是由黏附分子來介導(dǎo)的。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和β2-整合素(Mac-1)在炎癥反

7、應(yīng)過程中介導(dǎo)白細胞和血管內(nèi)皮細胞的黏附。IL-8屬于趨化因子CXC(Cysteines-X-Cysteines)家族，可趨化和激活中性粒細胞，并參與中性粒細胞與內(nèi)皮細胞粘附過程的調(diào)節(jié)，其濃度梯度構(gòu)成了中性粒細胞穿越血管內(nèi)皮的基礎(chǔ)，在中性粒細胞介導(dǎo)的腦缺血后炎性損傷中可能起樞紐作用。腦組織髓過氧化物酶(MPO)的活性可間接反映白細胞的浸潤程度。 本實驗依據(jù)腦出血后炎癥反應(yīng)的特點，采用免疫組織化學(xué)方法探討新清開靈對腦出血后48小時和

8、7天ICAM-1和Mac-1蛋白表達的影響。同時，用ELISA法和紫外分光光度法測定大鼠腦出血后腦組織IL-8含量和MPO活性的變化。 實驗結(jié)果顯示，出血后模型組腦組織切片ICAM-1陽性血管數(shù)和Mac-1陽性細胞與正常組相比顯著增加；腦組織勻漿IL-8含量和MPO活性均明顯升高。新清開靈組ICAM-1陽性血管數(shù)目及棕黃色顆粒較模型組明顯較少；同時能夠明顯降低MPO活性，但對IL-8含量沒有顯著的影響。說明新清開靈能夠抑制腦出血

9、后ICAM-1和Mac-1的表達，從而抑制白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附，減輕出血早期中性粒細胞的浸潤，改善出血后繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。這可能是新清開靈改善出血后炎性損傷的機制之一。 4.新清開靈減輕腦出血后自由基損傷的作用 腦出血后所產(chǎn)生的自由基堆積是造成繼發(fā)性腦損傷的機制之一。大量自由基可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其自身也具有毒性作用；SOD作為超氧自由基清除劑，能催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O和

10、O2，阻斷脂質(zhì)過氧化級聯(lián)反應(yīng)。 本實驗分別用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸(TAB)縮合法測定大鼠腦組織勻漿MDA含量和SOD活力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出血后48小時和7天MDA含量明顯上升，同時SOD活力顯著下降。新清開靈能夠降低腦出血后MDA水平，明顯提高自由基清除劑SOD的活力，以出血后48小時效果顯著。 綜合分析以上各個作用環(huán)節(jié)可以得出結(jié)論：新清開靈注射液能夠顯著抑制腦出血后小膠質(zhì)細胞的過度活化，明顯阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生