丁酸鈉抑制缺氧致血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　血管內(nèi)皮通透性的增加是很多疾病的病理基礎(chǔ)。缺氧是臨床常見的病理過程，是多種疾病的重要致病因素。研究表明，缺氧可以改變內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接作用，破壞血管內(nèi)皮的完整性，使細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞間連接復(fù)合物的結(jié)構(gòu)破壞，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，如何保護(hù)血管內(nèi)皮的完整性，抑制缺氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高，仍然缺乏有效的措施。丁酸鈉（Sodium butyrate，NaB）作為一種常見的短鏈脂肪酸，由腸道菌群對纖維性

2、食物的消化間接產(chǎn)生。以往的研究表明，丁酸鈉可通過抑制缺氧及炎癥因子，在動脈粥樣硬化和血管重構(gòu)的防治中發(fā)揮重要作用。另外，丁酸鈉在維持血管細(xì)胞屏障功能方面也起作用，能上調(diào)緊密連接蛋白，維持正常的血管內(nèi)皮通透性。丁酸鈉在血管疾病中的應(yīng)用前景，已得到廣泛關(guān)注。但是，丁酸鈉對缺氧所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高是否產(chǎn)生影響以及作用機(jī)制如何，尚不明確。本課題旨在研究丁酸鈉在缺氧所致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變中的作用，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　

3、　方法：
　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）分為常氧組、缺氧組和缺氧+丁酸鈉組（n=3）。采用三氣培養(yǎng)箱復(fù)制缺氧（1％O2）HUVEC模型，常氧組（21%O2） HUVECs于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　1.采用transwell小室分析HUVECs通透性；免疫熒光實驗采用cy5-BSA檢測HUVECs跨細(xì)胞通透性改變。
　　2.免疫印跡實驗檢測 p120、β-catenin蛋白表達(dá)；免疫熒光實驗觀察p120蛋白表達(dá)。

4、
　　3.通過CHX抑制蛋白合成和MG-132抑制蛋白降解，檢測p120蛋白表達(dá)。
　　4. Carboxy-PTIO抑制 NO，檢測 p120蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染siRNA（eNOS），檢測p120蛋白表達(dá)。
　　5.免疫印跡實驗檢測 eNOS蛋白表達(dá)；一氧化氮檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清液和細(xì)胞蛋白 NO水平；免疫熒光實驗檢測p120和eNOS的定位。
　　結(jié)果：
　　1.丁酸鈉對缺氧所致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變

5、的影響：缺氧12h時，培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著增高，與常氧組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（ P＜0.05）；與單純?nèi)毖踅M相比，缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫熒光實驗觀察缺氧組和缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cy5-BSA熒光強度與常氧組相比，沒有明顯差異。2.丁酸鈉對缺氧條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p120蛋白的影響：缺氧12h條件下，人臍靜脈內(nèi)皮

6、細(xì)胞p120蛋白表達(dá)顯著降低，與常氧組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而β-catenin蛋白表達(dá)與常氧組相比，差異不明顯（P＞0.05）；與單純?nèi)毖踅M相比，缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 p120蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與單純?nèi)毖踅M相比，缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p120蛋白熒光強度增加。
　　3.缺氧條件下p120蛋白穩(wěn)定性的變化：缺氧12h條件下，缺氧

7、+MG-132（25μmol/L）組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 p120蛋白表達(dá)顯著增高，與單純?nèi)毖踅M相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；放線菌酮抑制蛋白合成實驗結(jié)果顯示：常氧組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p120蛋白的半衰期為16h，缺氧組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 p120蛋白的半衰期為11h，而缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p120蛋白的半衰期為25h。
　　4. NO在缺氧 p120蛋白表達(dá)變化中的作用：缺氧+Carboxy-PT

8、IO（0.3mmol/L）組與缺氧組相比，p120蛋白表達(dá)水平顯著增高，差異具有計學(xué)差異（P＜0.05）。
　　5. eNOS在缺氧p120蛋白表達(dá)變化中的作用：缺氧12h條件下，轉(zhuǎn)染siRNA（eNOS）后檢測，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p120蛋白表達(dá)與對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.丁酸鈉對缺氧所致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)以及NO分泌的影響：缺氧12h條件下，缺氧+丁酸鈉

9、組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 eNOS蛋白表達(dá)與單純?nèi)毖踅M相比，差異不明顯（P＞0.05）；常氧組、缺氧組、缺氧+丁酸鈉組，細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞蛋白 NO水平無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　7.丁酸鈉對缺氧所致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS/p120共定位變化的影響：缺氧12h條件下，與單純?nèi)毖踅M相比，缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS/p120熒光重合部位減少。
　　結(jié)論：
　　1.缺氧導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮

10、細(xì)胞通透性增加，丁酸鈉對所缺氧致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加具有抑制作用。
　　2.缺氧導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 p120蛋白表達(dá)降低，而丁酸鈉可顯著提高缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p120蛋白表達(dá)，提示丁酸鈉對缺氧所致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通透性的保護(hù)作用是通過上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p120蛋白表達(dá)來實現(xiàn)的。
　　3.丁酸鈉可提高 p120蛋白穩(wěn)定性，上調(diào)缺氧組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p120蛋白表達(dá)；
　　4. eNOS蛋白水平降低促進(jìn)缺氧條件