src抑制的蛋白激酶C底物在炎癥因子所致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化中的作用.pdf

1、研究背景:
　　 肺部炎癥反應(yīng)過(guò)程中，構(gòu)成微循環(huán)交換血管最內(nèi)層的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）是炎癥因子首先攻擊的效應(yīng)細(xì)胞，其病理生理改變之一是細(xì)胞通透性增加，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肺水腫，這是急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）的主

2、要發(fā)病環(huán)節(jié)之一。多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與PMVECs通透性調(diào)控，其中蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被廣泛研究。已知活化的PKC磷酸化底物蛋白、促進(jìn)PMVECs骨架重構(gòu)以及細(xì)胞間黏附連接物解聚，從而增加PMVECs通透性，但細(xì)胞內(nèi)PKC下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)錯(cuò)綜復(fù)雜，所以PKC底物及其在PMVECs通透性調(diào)控中的作用機(jī)制值得深入研究。此外，在人體研究PMVECs通透性變化十分困難，目前關(guān)于PMVECs通透性的研究結(jié)果

3、主要來(lái)自體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，所以PMVECs單層的融合狀態(tài)決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確性。
　　 Src抑制的蛋白激酶C底物（src-suppressed C kinase substrate，SSeCKS）是一新發(fā)現(xiàn)的PKC底物，可被活化的PKC磷酸化。多種細(xì)胞株研究發(fā)現(xiàn)SSeCKS蛋白參與肌動(dòng)蛋白骨架和血腦屏障的動(dòng)態(tài)調(diào)控，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)大鼠PMVECs高表達(dá)SSeCKS蛋白，這些研究提示SSeCKS

4、可能是PMVECs通透性調(diào)控的重要效應(yīng)分子，但其在炎癥因子如白介素（interleukin，IL）-1β和腫瘤壞死因子（tumor necrosin factor，TNF）-α誘導(dǎo)PMVECs通透性增加中的具體作用仍未闡明。除LPS外，其他在肺部炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的炎癥介質(zhì)是否參與PMVECs中SSeCKS的誘導(dǎo)表達(dá)也未見(jiàn)報(bào)道。
　　 IL-17F是一種新的炎癥因子，大量研究表明在支氣管上皮細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，IL-1

5、7F通過(guò)誘導(dǎo)IL-6、IL-8和細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)觸發(fā)一系列炎癥反應(yīng)；肺炎克雷伯桿菌、支原體或白色念珠菌感染后，肺部增加的IL-17F誘發(fā)中性粒細(xì)胞聚集和變態(tài)反應(yīng)，這些研究提示IL-17F是參與肺部炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。目前關(guān)于肺部IL-17F作用機(jī)制的研究主要集中在支氣管上皮細(xì)胞，并且對(duì)其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路知之甚少，PMVECs是肺部炎癥反應(yīng)時(shí)的主要效應(yīng)細(xì)胞，但關(guān)于IL-17F對(duì)PMVECs的刺激效應(yīng)以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究

6、卻未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的:
　　 觀察PMVECs單層融合前后的生物學(xué)特征。融合PMVECs單層用于實(shí)驗(yàn)，觀察IL-17F對(duì)PMVECs通透性的影響以及SSeCKS信號(hào)通路在IL-1β、TNF-α和IL-17F誘導(dǎo)PMVECs通透性變化中的作用，為認(rèn)識(shí)ALI/ARDS發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 體外培養(yǎng)大鼠PMVECs；在Transwell和硝酸醋酸混合纖維膜上構(gòu)建PMVECs單層；倒置顯

7、微鏡、蘇木素-伊紅染色、跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻（transendothelial electrical resistance，TER）、異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖法（Pd）以及Hank’s平衡液法（LP）觀察細(xì)胞單層生物學(xué)特征；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析SSeCKS的mRNA變化；免疫印跡技術(shù)分析PKC活性以及SSeCKS蛋白變化；應(yīng)用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽觀察PMVECs肌動(dòng)蛋白骨架改變；此外，PMVECs還被特異性的SSeCKS小分子干擾R

8、NA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染。
　　 結(jié)果:
　　 1）1×105/cm2的PMVECs接種Transwell后，TER隨接種時(shí)間延長(zhǎng)穩(wěn)定升高，接種后第四天達(dá)最高，爾后維持，第十天TER開(kāi)始下降，而倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞接種后第三天已融合成單層；2×105/cm2的PMVECs接種Transwell后，TER達(dá)高峰時(shí)間提前到接種后第二天，第九天TER開(kāi)始下降；不同密度接種組的TER最高

9、值間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。靜息狀態(tài)下融合PMVECs單層TER為48.07±2.84 Ω·cm2、Pd為6.19±0.43×10-6 cm/s、LP為6.80±0.62×10-7 cm/s/cm H2O。
　　 2）10mg/L LPS分別刺激融合PMVECs單層0.5h和2h后，與未處理對(duì)照組比較，TER顯著下降、LP和Pd均顯著增加。
　　 3）5ng/ml IL-1β和10ng/ml TNF-α分別激活

10、PMVECs的PKC信號(hào)通路和誘導(dǎo)SSeCKS的mRNA和蛋白高表達(dá)，IL-1β+TNF-α誘導(dǎo)SSeCKS表達(dá)的效應(yīng)更顯著；BIM (1μmol/L，PKC抑制劑) 顯著下調(diào)PMVECs的PKC活性和抑制IL-1β+TNF-α誘導(dǎo)SSeCKS的mRNA和蛋白高表達(dá)，而蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）抑制劑（H89，10μmol/L）和蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）抑制劑（

11、金雀異黃素，50μg/ml）不影響IL-1β+TNF-α誘導(dǎo)SSeCKS的mRNA和蛋白高表達(dá)。
　　 4）與未處理組比較，50nmol/L SSeCKS-siRNA轉(zhuǎn)染PMVECs 12h后，SSeCKS mRNA表達(dá)顯著下降、24h達(dá)最低值、持續(xù)到轉(zhuǎn)染后96h，SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS蛋白表達(dá)的最佳時(shí)間在轉(zhuǎn)染48h后，抑制率接近50％，抑制效應(yīng)持續(xù)到轉(zhuǎn)染后120h；SSeCKS-siRNA轉(zhuǎn)染還以濃度依賴(lài)方式

12、（10、20、50 nmol/L）沉默SSeCKS mRNA和蛋白表達(dá)。無(wú)論是脂質(zhì)體空轉(zhuǎn)染、普通陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染還是SSeCKS-siRNA轉(zhuǎn)染均使融合PMVECs的靜息狀態(tài)TER輕微下降、靜息狀態(tài)Pd略升高，但與未處理組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 5）IL-1β+TNF-α刺激顯著下調(diào)PMVECs的TER和增加PMVECs的Pd，SSeCKS-siRNA轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)IL-1β+TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞單層通透性

13、的增加，但改善效果與BIM的改善效果比較存在差異（P<0.05）。
　　 6）不同濃度IL-17F（0.1、1、10、100ng/ml）刺激PMVECs 3h后，下降的TER和增加的Pd與未處理組比較差異顯著；100ng/ml IL-17F刺激細(xì)胞0.5h后，Pd與未處理組比較增加了15％、3～6h后Pd達(dá)高峰、顯著增加的Pd持續(xù)到刺激后24h；同Pd變化，IL-17F刺激PMVECs單層時(shí)，TER呈時(shí)間依賴(lài)性下降；1、10μm

14、ol/L BIM均能改善IL-17F誘導(dǎo)增加的Pd和下降的TER，但都未能使其恢復(fù)到正常值。
　　 7）IL-17F刺激3h后，PMVECs的絲狀肌動(dòng)蛋白重組：從細(xì)胞周邊向細(xì)胞中心轉(zhuǎn)移并成平行束狀堆積、增厚，同時(shí)細(xì)胞旁縫隙顯著增大；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-17F刺激后，PMVECs中絲狀肌動(dòng)蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度曲線(xiàn)向右位移、其平均熒光強(qiáng)度與未處理組比較顯著增加，而1、10μmol/L BIM均能有效改善IL-17F誘導(dǎo)PMVEC

15、s肌動(dòng)蛋白骨架的重構(gòu)。
　　 8）不同濃度（0.1、1、10、100ng/ml）IL-17F刺激PMVECs后，SSeCKS的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加；100ng/ml IL-17F刺激PMVECs時(shí)，SSeCKS基因表達(dá)在刺激后3h達(dá)高峰，而蛋白表達(dá)在刺激后6h達(dá)高峰；IL-17F刺激PMVECs 5min后，SSeCKS蛋白的絲氨酸被磷酸化、30min后顯著、3～6h后達(dá)高峰、后維持在較高的磷酸化水平至刺激后24h，而1

16、μmol/L BIM預(yù)孵育后，IL-17F誘導(dǎo)增加的蛋白磷酸化水平顯著下降；此外，IL-17F刺激PMVECs 30min后，不溶于Triton-X-100的SSeCKS蛋白顯著增加，3～6h后，不溶于Triton-X-100的SSeCKS蛋白達(dá)高峰；最后，靜息狀態(tài)時(shí)，SSeCKS蛋白大部分集中在細(xì)胞質(zhì)，IL-17F刺激30min后，細(xì)胞膜部SSeCKS蛋白的量與靜息狀態(tài)比較差異顯著，刺激90min后，SSeCKS大部分集中在細(xì)胞膜。<

17、br>　　 結(jié)論:
　　 1）TER聯(lián)合倒置顯微鏡較倒置顯微鏡單獨(dú)應(yīng)用能更準(zhǔn)確判定PMVECs單層融合狀態(tài)；2）TER、Pd、LP均能有效檢測(cè)PMVECs單層通透性變化，TER聯(lián)合Pd更多地反映PMVECs通透性變化信息；3）SSeCKS表達(dá)增加上調(diào)PMVECs通透性在ALI/ARDS復(fù)雜機(jī)制中占重要地位，IL-1β、TNF-α和IL-17F是PMVECs高表達(dá)SSeCKS基因和蛋白的強(qiáng)有力誘導(dǎo)劑，PKC而非PKA、PTK信號(hào)