Caveolin-1在TNF-α誘導大鼠肺微血管內皮細胞通透性變化中的作用機制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)是臨床常見急危重癥,發(fā)病機制尚不完全清楚,臨床缺乏有效治療手段,病死率高。盡管已明確炎性介質作用于肺微血管內皮細胞(PMVECs)是導致ARDS的重要原因,但研究表明,單純通過阻斷或封閉炎性介質難以取得理想效果。近些年來,研究的熱點逐步轉向那些能夠將多種信號通路聯(lián)系在一起,并對它們進行調節(jié)的蛋白質身上,如小窩蛋白-1,試

2、圖由此開辟一條ARDS發(fā)病機制研究的新方向。
　　小窩(Caveolae)又稱膜內陷囊泡,是細胞膜表面特異性的內陷囊狀結構,廣泛分布于機體內,參與細胞分化、增殖、炎癥、腫瘤、衰老等多種病理生理過程。Caveolae在調控微血管內皮細胞通透性方面的研究并不多見并且各項研究的結果尚存在很大的爭論:部分研究報道小窩蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)的敲除增加血管內皮的通透性,另一部分研究認為敲除Caveolin-1會導致血管內

3、皮通透性的降低。因此,小窩在肺微血管內皮通透性中的作用機制還有待進一步研究。
　　炎癥介質如:腫瘤壞死因子-α(TNF-α),內毒素(LPS)和凝血酶等,引起內皮細胞通透性增加,主要是導致內皮細胞間縫隙的形成。而其機制包括:誘導細胞骨架蛋白的重構,導致細胞收縮以及破壞細胞間的連接。而細胞骨架蛋白的重構和細胞間的連接受到多種信號通路的調節(jié)。小G蛋白家族由于能夠調節(jié)細胞間粘附和細胞骨架的動力,很早被認為在調控內皮屏障功能中居于重要的地

4、位,尤其是Rac1可以通過調控內皮細胞骨架蛋白F-actin的重構,加強細胞間的連接,增強內皮細胞的屏障功能。
　　皮質肌動蛋白結合蛋白(cortactin)是廣泛存在的酪氨酸激酶的靶點,是Rac1信號通路的主要效應蛋白之一,牽涉到皮層肌動蛋白的組裝和重構。目前確定,在內皮功能加強的情況下,cortactin在細胞邊界處聚集,導致皮層肌動蛋白分布增加,功能增強,而這一過程依賴于Rac1的激活。在Cortactin基因敲除的內皮細胞

5、,那些能夠穩(wěn)定內皮屏障功能的藥物如cAMP、PGE2和PGI2等并不能夠降低炎癥因子誘導的內皮通透性增高。
　　綜上所述,Rac1-cortactin信號通路在血管內皮細胞單層通透性調控中具有重要作用,而caveolin-1對血管內皮通透性的影響是否與該通路有關,目前尚未見報道。
　　目的:
　　構建caveolin-1基因RNA干擾慢病毒,觀察抑制caveolin-1基因表達對TNF-ɑ誘導的RPMVECs通透性變化

6、的影響,探討其作用機制,豐富ARDS的基礎理論,并為臨床防治ARDS提供新的思路。
　　方法:
　　1.pLL3.7-caveolin-1shRNA慢病毒表達載體構建:確定編碼caveolin-1-shRNA的DNA序列,將其克隆至慢病毒表達載體pLL3.7上并進行慢病毒包裝、分離以及滴度的測定。
　　2.RPMVECs的分離、培養(yǎng)和鑒定:采用體外肺組織塊貼壁法行原代RPMVECs分離、培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察,RPMV

7、ECs形態(tài)學特征,并采用植物凝集素結合試驗進行鑒定。
　　3.慢病毒(含載體pLL3.7-caveolin-1shRNA)感染RPMVECs及鑒定:慢病毒(含載體pLL3.7-caveolin-1shRNA)感染RPMVECs,感染后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,采用稀釋計數法測定病毒滴度,用Western-blotting法鑒定轉染RPMVECs中目的蛋白表達情況,確定caveolin-1表達抑制的效率。
　　4.抑制C

8、aveolin-1基因表達對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響及作用機制
　　RPMVECs分為正常細胞、轉染目的基因的細胞及轉染空載體的細胞。按照如下實驗方案分組:正常細胞未刺激組,正常細胞TNF-α刺激組,正常細胞O-Me-cAMP刺激組,正常細胞O-Me-cAMP+TNF-α共刺激組,陰性沉默對照組(controlshRNA),陰性沉默(controlshRNA)細胞TNF-α刺激組,Caveolin-1基因沉默組(

9、Caveolin-1shRNA),Caveolin-1基因沉默細胞+TNF-α刺激組,Caveolin-1基因沉默細胞+NSC23766+TNF-α刺激組。
　　1)抑制Caveolin-1基因表達對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響:采用跨內皮細胞電阻(transendothelialelectricalresistance,TER)、異硫氰酸熒光素標記白蛋白法觀察細胞單層通透性變化。
　　2)抑制Caveolin

10、-1基因表達對TNF-α引起肺微血管內皮骨架蛋白重構的影響:免疫熒光染色激光共聚焦觀察F-actin和cortactin分布變化;western-blot半定量分析cortactin在胞漿和胞膜量的變化。
　　3)抑制Caveolin-1基因表達對TNF-α引起肺微血管內皮單層通透性變化、內皮細胞骨架蛋白重構產生影響的信號轉導機制:Pull-down及western-blot半定量分析Rac1活性。
　　結果:
　　1

11、.經酶切和測序證實,成功構建慢病毒表達載體pLL3.7-caveolin-1shRNA,病毒包裝后經濃縮得到的病毒懸液滴度為2×108TU/ml。
　　2.獲得原代培養(yǎng)的RPMVECs,經光鏡下的細胞形態(tài)學特征和植物凝集素結合試驗加以鑒定。
　　3.慢病毒感染RPMVECs后,在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。Westernblotting法可檢測到相應目的蛋白表達,24h后即出現(xiàn)caveolin-1的表達抑制,48h抑制

12、caveolin-1的表達至陰性沉默對照組caveolin-1表達水平的60±10％;72h抑制達最小值約為陰性沉默對照組的10±2%。而陰性沉默對照組caveolin-1表達水平在0、24、48、72h變化不大,差異無統(tǒng)計學意義。
　　4.抑制caveolin-1基因表達對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響及作用機制
　　1)抑制caveolin-1基因表達對TNF-α引起RPMVECs高通透性的影響:100ng/

13、mlTNF-α刺激RPMVECs單層時,TER呈時間依賴性下降;在刺激2小時,TER下降最顯著,降到基礎值的63±5%;FITC-BSA的通透率升高最顯著,達到基礎值的205±23%;200mMO-Me-cAMP能抑制TNF-α誘導的TER的下降和FITC-BSA通透率的增加。抑制caveolin-1表達,靜息狀態(tài)下TER較controlshRNA組升高到116±10%,FITC-BSA的通透率較controlshRNA組略有降低,但差

14、異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。當caveolin-1shRNA組和controlshRNA組細胞單層受TNF-α刺激2h,caveolin-1shRNA組TER的值降到刺激前的78±7%,controlshRNA組TER的值降到刺激前的59±4%,可見caveolin-1shRNA組TER值下降程度較controlshRNA組為少,兩組間比較(78±7%vs59±4%)差異有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.05);觀察FITC-BSA通透率方

15、面變化可見:controlshRNA組在受到TNF-α刺激2h后,FITC-BSA的通透率明顯增加到刺激前的197±27%,caveolin-1-shRNA組通透率升高到刺激前的122±11%,兩組間比較有顯著性差異(197±27%vs122±11%,p<0.05)。敲除caveolin-1可以抵御TNF-α誘導的內皮通透性的增加。Rac1的抑制劑-NSC23766能取消敲除caveolin-1帶來的內皮屏障保護效應。
　　2)抑

16、制caveolin-1表達對PMVECsF-actin和cortactin分布的影響:TNF-α刺激control-shRNA細胞2小時可見:F-actin外周致密帶邊緣變得毛糙不規(guī)整、排列紊亂,細胞邊界已不可辨,F-actin重組,從細胞周邊向細胞中心轉移并成平行束狀堆積、增厚,細胞中央應力纖維形成,而胞漿中分布的cortactin變得紊亂,皮質區(qū)和細胞膜上的分布也變得很不明顯;細胞邊界模糊,形態(tài)不清,而western-blot半定量

17、分析顯示膜上cortactin蛋白含量明顯減少。caveolin-1-shRNA組:F-actin重組明顯,從細胞中央向細胞周邊轉移并形成皮質區(qū)F-actin增厚強化,細胞中央束狀應力纖維形成明顯減少,細胞偽足形成明顯。而胞漿中分布的cortactin明顯向膜上轉位,在細胞皮質區(qū)分布明顯,并在細胞膜上成線樣強化分布;western-blot半定量分析顯示膜上cortactin蛋白含量明顯增加。給予TNF-α刺激2h,皮質區(qū)F-actin

18、分布強化依舊明顯,胞漿區(qū)F-actin分布比較紊亂,但細胞中央的束狀應力纖維比較明顯,細胞偽足形成仍可見到;細胞皮質區(qū)和偽足區(qū)cortactin分布減少不明顯,胞漿區(qū)cortactin分布也沒有明顯減少,western-blot半定量分析顯示膜上cortactin蛋白含量較TNF-α刺激前減少不明顯,但是較control-shRNA+TNF-α組明顯增加。
　　3)抑制caveolin-1表達對Rac1信號通路活性的影響:抑制ca

19、veolin-1表達可以增加RPMVEC內Rac1的活性,抑制TNF-α導致的RPMVEC內Rac1活性的降低:在靜息情況下shRNA方法沉默caveolin-1基因表達可以明顯增加內皮細胞中Rac1酶的活性,較陰性沉默對照組(controlshRNA)升高2.5±0.2倍(n=6,P<0.01);而在TNF-α刺激2h后,caveolin-1-shRNA組Rac1酶的活性是controlshRNA組酶活性的2.7±0.4倍(n=6,P

20、<0.01)。
　　結論:
　　1.成功構建caveolin-1基因表達抑制的RPMVECs單層模型。
　　2.抑制caveolin-1表達,可以減輕TNF-α所致RPMVECs單層通透性的增加。
　　3.TNF-α引起Rac1活性的降低,可能是其導致RPMVECs通透性增高的機制之一。抑制caveolin-1表達可以上調Rac1的活性導致皮質區(qū)cortactin和F-actin骨架蛋白分布的增加,加強細胞間連接