細胞骨架重構在VEGF與TNF-α促進漢坦病毒感染致血管內皮細胞通透性增高中的作用及其機制.pdf

1、漢坦病毒（hantanvirus）是腎綜合征出血熱（hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（hantaviruspulmonarysyndrome,HPS）的病原體。致病性漢坦病毒感染人體后以毛細血管和小血管的內皮細胞為主要靶細胞，在感染后數(shù)周內引發(fā)以血管滲漏綜合征（vascularleakagesyndrome,CLS）和腎功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的臨床綜合征。目前血管內皮細胞損

2、傷的機制研究主要包括病毒與其受體β3整合素結合后直接影響內皮細胞功能致病學說和以血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）、腫瘤壞死因子（TumorNecrosisFactor-α,TNF-α）等炎癥介質升高和相關免疫細胞功能變化等免疫學致病學說。而具體機制有待深入研究。
　　細胞骨架重構是調節(jié)血管內皮通透性升高的重要機制，而β3整合素和VEGF、TNF-α等均參與細胞骨架的調節(jié)。

3、所以本研究以漢灘病毒（hantaanvirus,HTNV，致病性漢坦病毒中的主要型別）和體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞（humanumbilicalveinendothelialcell,HUVECs）為研究對象，以細胞骨架為切入點，研究細胞骨架重構是否參與了漢坦病毒感染以及VEGF、TNF-α對體外培養(yǎng)的血管內皮細胞通透性的影響；觀察調節(jié)細胞骨架重構的重要分子RhoA/Rock/p-MLC的變化，以及Rock激酶抑制劑Y27632能否阻斷

4、或部分阻斷血管內皮通透性的變化。旨在探討漢坦病毒感染所致的血管內皮高通透性的發(fā)病機理，并為下一步深入研究減輕細胞高通透性的藥物研究提供實驗依據(jù)。
　　主要研究方法和內容
　　1.HTNV感染對HUVECs通透性影響
　　實驗（一）首先擴增并滴定HTNV76-118毒株并感染體外培養(yǎng)的HUVECs。運用跨內皮電阻測定（transepithelialelectricalresistance,TEER）、免疫熒光染色、流式細

5、胞術等技術觀察HTNV感染HUVECs不同時間點對內皮細胞通透性的影響，為后續(xù)實驗提供相關數(shù)據(jù)及操作經(jīng)驗。
　　2.細胞骨架重構在VEGF促進HTNV感染致HUVECs高通透性中的作用及機制
　　實驗（二）中以體外培養(yǎng)的HUVECs為對象，應用粘附實驗、Transwell技術及流式細胞技術，觀察VEGF對HTNV感染HUVECs的通透性、粘附能力和遷移能力的改變，分析β3與VEGFR2表達數(shù)量的變化；用熒光染色技術標記顯示細

6、胞骨架的重構；電子顯微鏡觀察細胞間連接結構的變化；免疫蛋白印跡（western-blot）、逆轉錄實時定量PCR（qRT-PCR）方法檢測β3-VEGFR2功能復合物下游參與細胞骨架重構的重要分子RhoA/Rock激酶、磷酸化的肌球蛋白輕鏈（myosinlightchainphosphorylation,P-MLC）蛋白和mRNA水平上的變化。以上實驗擬證實致病性漢坦病毒感染不僅影響β3整合素的功能，而且影響β3-VEGFR2復合物的功

7、能，這可能是HFRS病程中VEGF水平升高而加劇血管內皮通透性的原因之一；RhoA/Rock/p-MLC分子通路參與的細胞骨架重構可能是VEGF促進HTNV感染HUVECs通透性升高的機制之一；Rock激酶的抑制劑Y27632可以部分阻斷或減弱VEGF促進HTNV感染HUVECs高通透性的作用。
　　3.細胞骨架重構在TNF-α致HTNV感染致HUVECs高通透性中的作用
　　既往研究顯示TNF-α的增高也參與了HFRS病程

8、血管通透性的調節(jié)。而細胞骨架重構可能是TNF-α增加內皮細胞的通透性的重要通路。
　　實驗（三）采用內皮細胞電阻儀、免疫熒光染色、western-blot、qRT-PCR、電子顯微鏡等與第二部分實驗中類似的實驗方法觀察TNF-α對HTNV感染的HUVECs通透性的作用，伴隨通透性改變的細胞骨架重構情況、相鄰細胞間連接結構的變化，RhoA/Rock/p-MLC等分子表達的變化；以及Y27632對上述作用有否影響。
　　主要結果

9、：
　　1.單純HTNV感染可以導致體外培養(yǎng)的HUVECs通透性升高。
　　2.VEGF可以明顯促進HTNV感染HUVECs通透性的升高，并伴隨有β3整合素-VEGFR2復合體功能失調及細胞骨架的重構。
　　3.RhoA/Rock/P-MLC分子通路可能參與VEGF介導的細胞骨架重構所致的通透性升高；Rock激酶抑制劑Y27632可以明顯減輕上述作用。
　　4.TNF-α可明顯促進HTNV感染HUVECs通透性的

10、升高，并伴隨有細胞骨架的重構。
　　5.RhoA/Rock/P-MLC分子通路可能參與TNF-α介導的細胞骨架重構所致的通透性升高；Rock激酶抑制劑Y27632可以明顯減輕上述作用。
　　結論：
　　1.細胞骨架重構可能是VEGF和TNF-α促進HTNV感染致HUVECs的高通透性的重要機制之一。
　　2.RhoA/Rock/p-MLC分子通路可能是調節(jié)上述細胞骨架重構的重要信號途徑，Rock激酶抑制劑Y276