血管緊張素Ⅱ在腫瘤乏氧微環(huán)境中生成的機制及介導腫瘤輻射抵抗的作用.pdf

1、目的:
　　研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ主要存在于腫瘤的乏氧區(qū)域，并且是由腫瘤細胞通過糜蛋白酶(chymase，CMA)依賴的途徑產(chǎn)生，而不是ACE依賴的經(jīng)典RAS途徑。并進一步揭示了糜蛋白酶依賴途徑受到糖酵解代謝產(chǎn)物——乳酸水平調(diào)節(jié)，而且在乏氧腫瘤細胞中AngⅡ水平的增加對于HIF-1α在細胞內(nèi)的累積起重要作用，并介導了乏氧腫瘤細胞的輻射抵抗。這不僅為深入理解頭頸部腫瘤乏氧介導的輻射抵抗機制提供新的理論依據(jù)，而且為克服頭頸部腫瘤放療抵抗從

2、而減少放療后殘留及復發(fā)提供了新的思路和手段。
　　方法:
　　1.檢測頭頸部腫瘤中血管緊張素Ⅱ在腫瘤乏氧區(qū)域的表達
　　運用ELISA實驗及細胞免疫熒光實驗檢測鼻咽癌細胞株和乳腺癌細胞株在體外不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）下的血管緊張素Ⅱ表達情況。構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，結(jié)合HIF-1α抗體，利用免疫熒光技術(shù)分析血管緊張素Ⅱ在腫瘤組織中的分布與HIF-1α表達區(qū)域的相關(guān)性，進而分析AngⅡ與腫瘤乏氧區(qū)域的相關(guān)性。利用免疫熒光

3、技術(shù)分析血管緊張素Ⅱ在人鼻咽癌標本中的分布與HIF-1α表達區(qū)的相關(guān)性，進而分析AngⅡ與腫瘤乏氧區(qū)域的相關(guān)性。
　　2.檢測乏氧情況下腫瘤細胞產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ的機制
　　利用AGT慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定抑制血管緊張素原表達的鼻咽癌細胞株CNE2和5-8F，并運用ELISA實驗檢測鼻咽癌細胞培養(yǎng)基中AngⅡ的表達。通過皮下注射上述細胞株建立小鼠移植瘤模型，運用免疫熒光技術(shù)分析移植瘤組織內(nèi)AngⅡ與哌莫硝唑標記的腫瘤乏氧區(qū)域的相關(guān)

4、性。通過熒光定量PCR及Western B1ot技術(shù)檢測乏氧腫瘤細胞中血管緊張素原(AGT)、腎素(Renin)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的基因及蛋白的表達水平。針對RENIN和ACE各設計3條短干擾RNA片段(siRNA)，使用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制細胞中RENIN和ACE的表達。然后利用ELISA實驗檢測不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）下鼻咽癌細胞株RENIN和ACE沉默后AngⅡ的表達情況。利用基因表達微陣列分析的方法找出顯著影響腫瘤細胞An

5、gⅡ形成的糜蛋白酶(chymase，CMA)，并使用Western Blot進一步證實。然后通過構(gòu)建CMA的慢病毒載體抑制其表達，使用ELISA實驗檢測不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）下鼻咽癌細胞株CMA沉默后的AngⅡ表達情況。
　　3.檢測改變培養(yǎng)基pH或加入乳酸是否影響腫瘤細胞血管緊張素Ⅱ的表達
　　通過使用1％鹽酸(HCl)和5％碳酸氫鈉(NaHCO3)將常氧條件下腫瘤細胞培基pH調(diào)整至乏氧條件培養(yǎng)的水平，或者將乏氧條件下腫

6、瘤細胞培基pH調(diào)整至常氧條件培養(yǎng)的水平，然后使用ELISA實驗檢測pH調(diào)整后腫瘤細胞培基中AngⅡ表達情況。使用乳酸檢測試劑盒檢測不同氧環(huán)境下（常氧及乏氧）鼻咽癌細胞中乳酸的表達情況，并運用ELISA的實驗方法檢測不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）的培養(yǎng)基中加入乳酸鈉提高細胞內(nèi)乳酸水平或者加入草氨酸鈉抑制細胞內(nèi)乳酸生成后鼻咽癌細胞的AngⅡ表達情況。
　　4.檢測腫瘤細胞產(chǎn)生的乳酸是否影響糜蛋白酶的表達
　　5.檢測乏氧腫瘤細胞中血管

7、緊張素Ⅱ與HIF-1α表達的關(guān)系
　　6.檢測血管緊張素Ⅱ與頭頸部腫瘤細胞輻射敏感性關(guān)系
　　7.統(tǒng)計分析
　　結(jié)果:
　　1.腫瘤乏氧區(qū)域存在局部血管緊張素Ⅱ
　　利用ELISA試劑盒檢測鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2、5-8F及乳腺癌細胞株MDA-MB-231不同氧濃度下的AngⅡ生成情況。結(jié)果顯示在體外普通培養(yǎng)條件(常氧)下，腫瘤細胞培養(yǎng)基中可檢測到少量AngⅡ生成，而在乏氧培養(yǎng)條件下，腫瘤細胞培養(yǎng)基

8、中AngⅡ水平顯著升高。運用細胞免疫熒光技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)常氧條件下培養(yǎng)的CNE2及MDA-MB-231僅有極少量的AngⅡ表達在胞漿中，而乏氧條件下培養(yǎng)的腫瘤細胞胞漿中AngⅡ表達明顯升高。在裸鼠的CNE2移植瘤模型中的熒光檢測發(fā)現(xiàn)AngⅡ主要集中在乏氧誘導因子HIF-1α高表達的乏氧區(qū)域。另外我們還收集了13例鼻咽癌腫瘤標本，用激光共聚焦顯微鏡觀察到AngⅡ與HIF-1α表達于鼻咽癌腫瘤標本的同一區(qū)域。在AGT穩(wěn)定敲除的鼻咽癌CNE2細胞

9、的動物移植瘤模型中，我們通過組織免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)在哌莫硝唑指示的腫瘤乏氧區(qū)域AngⅡ的表達明顯下降。這些結(jié)果均提示局部RAS存在于腫瘤的乏氧微環(huán)境中。
　　2.乏氧腫瘤細胞不是通過經(jīng)典的RAS途徑產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ
　　熒光定量PCR及Western Blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌CNE2細胞株中只有腎素在乏氧條件下其基因及蛋白水平顯著升高，而AGT與ACE在乏氧條件下與常氧相比具有相似的表達水平。在特異性敲除腎素的CNE2和5

10、-8F鼻咽癌細胞株中，通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)乏氧情況下兩細胞株培養(yǎng)基中的AngⅡ水平降低。而特異性敲除血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的CNE2和5-8F細胞株中則無此種改變。這些結(jié)果提示我們，在乏氧的腫瘤細胞中AngⅡ的產(chǎn)生可能并不依賴典型的RAS途徑。
　　3.乏氧腫瘤細胞通過糜蛋白酶依賴途徑產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ
　　基因表達微陣列分析結(jié)果顯示，在乏氧的CNE2細胞中糜蛋白酶轉(zhuǎn)錄顯著增加，并通過Western Blot進一步得到了證實。我們

11、利用慢病毒載體，構(gòu)建了穩(wěn)定敲除CMA的CNE2和5-8F細胞株。ELISA實驗結(jié)果顯示，乏氧培養(yǎng)環(huán)境中的鼻咽癌細胞株在CMA沉默后其AngⅡ表達較常氧情況下顯著降低。以上研究結(jié)果表明，在腫瘤的乏氧微環(huán)境中，糜蛋白酶介導AngⅡ的生成途徑可能是ACE依賴AngⅡ生成途徑的替代通路。
　　4.腫瘤來源的乳酸介導了乏氧腫瘤細胞血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生
　　運用ELISA檢測不同氧環(huán)境（常氧及乏氧）中鼻咽癌細胞CNE2及5-8F的培養(yǎng)基中

12、加入乳酸鈉提高細胞內(nèi)乳酸水平或者加入草氨酸鈉抑制細胞內(nèi)乳酸生成后其AngⅡ的表達水平。結(jié)果顯示，用HC1酸化培養(yǎng)基后并未顯著增加培養(yǎng)基中AngⅡ的含量，相反，利用5％碳酸氫鈉(NaHCO3)將乏氧條件下培養(yǎng)的腫瘤細胞培基pH調(diào)整至常氧條件培養(yǎng)的水平后AngⅡ的含量上升。以上研究結(jié)果表明酸性pH并不是影響乏氧腫瘤細胞CMA依賴途徑生成AngⅡ的主要因素。而乳酸測定的結(jié)果顯示，乏氧條件培養(yǎng)的CNE2及5-8F細胞中乳酸水平較常氧條件下顯著升

13、高。在CNE2及5-8F細胞的培養(yǎng)基中加入乳酸鹽后，ELISA檢測發(fā)現(xiàn)常氧及乏氧條件下的培養(yǎng)基中AngⅡ水平顯著增高，加入草氨酸鈉后抑制胞內(nèi)乳酸生成后AngⅡ水平則降低，而挽救實驗可恢復兩種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基中的AngⅡ水平。這就說明是乳酸而不是pH的降低引起乏氧腫瘤細胞中AngⅡ水平的增加。
　　5.腫瘤產(chǎn)生的乳酸調(diào)節(jié)腫瘤細胞中糜蛋白酶的表達
　　Western Blot檢測結(jié)果顯示，無論常氧還是乏氧培養(yǎng)條件，在CNE2細胞

14、培養(yǎng)基中加入乳酸鹽后其糜蛋白酶的表達增加，加入草氨酸鈉后則發(fā)生抑制。在CNE2細胞培養(yǎng)基中加入碳酸氫鈉堿化培養(yǎng)基后，兩種培養(yǎng)條件下的糜蛋白酶亦有所增加。此外，乳酸鹽及培養(yǎng)基的堿化也使腎素的表達一定程度上升高。這些研究結(jié)果表明，乏氧腫瘤細胞中乳酸水平的增加可能是造成糜蛋白酶表達升高的重要因素。
　　6.血管緊張素Ⅱ調(diào)節(jié)乏氧腫瘤細胞中HIF-1α蛋白的累積
　　Western Blot實驗顯示，AngⅡ處理及乏氧條件下的CNE2

15、細胞中HIF-1α蛋白顯著升高，而加入坎地沙坦后可抑制HIF-1α蛋白的升高。在AGT穩(wěn)定敲除的鼻咽癌CNE2細胞的動物移植瘤模型中，我們通過組織免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)AGT沉默后，大大減弱了HIF-1α蛋白在哌莫硝唑標記的腫瘤乏氧區(qū)域中的積累。這些實驗結(jié)果說明在乏氧腫瘤微環(huán)境中AngⅡ參與調(diào)節(jié)HIF1-α蛋白的累積。
　　7.局部生成血管緊張素Ⅱ介導了乏氧腫瘤細胞的輻射抵抗
　　克隆形成實驗顯示，乏氧條件下鼻咽癌CNE2及5-8

16、F細胞的輻射抵抗能力較常氧條件下顯著增加，而AT1R特異性拮抗劑坎地沙坦能逆轉(zhuǎn)乏氧條件造成的腫瘤細胞輻射抵抗，顯著增加其輻射敏感性。裸鼠的CNE2細胞株皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn)AT1R拮抗劑坎地沙坦處理組較對照組顯著減小了10Gy輻射后的腫瘤體積。在AGT穩(wěn)定敲除的鼻咽癌CNE2及5-8F細胞的動物移植瘤模型中，AGT沉默組小鼠的移植瘤體積在10Gy輻射后較陰性對照組顯著降低。這些結(jié)果均表明，腫瘤乏氧微環(huán)境中AngⅡ的增加介導了腫瘤的輻射抵抗，

17、使用AT1R拮抗劑坎地沙坦可以特異地在乏氧環(huán)境下增加腫瘤細胞的輻射敏感性。
　　結(jié)論:
　　本研究揭示了局部RAS主要存在于腫瘤的乏氧區(qū)域，腫瘤細胞可能主要通過糜蛋白酶(chymase，CMA)依賴的途徑產(chǎn)生AngⅡ，而不是ACE依賴的途徑，并以自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用。腫瘤細胞來源的乳酸，而非乏氧環(huán)境的pH降低，通過激活乏氧腫瘤細胞的腎素及糜蛋白酶的表達引起AngⅡ的生成增加。最后，我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ可使乏氧腫瘤細胞中H