解偶聯(lián)蛋白2在血管緊張素Ⅱ致線粒體活性氧生成中的作用.pdf

1、背景：大量的研究認(rèn)為：活性氧類物(ROS)，如超氧陰離子和過(guò)氧化氫等)參與多種病理生理過(guò)程，包括內(nèi)皮舒張功能減退，系統(tǒng)性高血壓，細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)以及觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與許多疾病包括心血管疾病、神經(jīng)變性、炎性疾病及感染：ROS在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)參與的病理生理活動(dòng)中起重要的作用；解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)屬線粒體陰離子攜帶者-大家族的成員之一，研究表明UCP2可以通過(guò)使氧化磷酸化與ATP合成解偶聯(lián)而降低線粒體內(nèi)膜電勢(shì)，從而抑

2、制ROS的生成。 目的：觀察血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位和活性氧的影響，探討解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)在該途徑中的作用。 方法：實(shí)驗(yàn)共分三部分。 (1)為了觀察AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞活性氧生成的影響，按干預(yù)濃度分為四組：對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)，AngⅡ0.1μmol/L組，AngⅡ1μmol/L組，AngⅡ10μmol/L組分別與HUVEC(原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)共同孵育24小時(shí)，RT-PCR

3、法定量UCP2mRNA表達(dá)，DCFH-DA檢測(cè)線粒體活性氧(流式細(xì)胞儀法)，羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位(流式細(xì)胞儀法)。 (2)為了觀察UCP2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的影響，首先通過(guò)UCP2反義寡核苷酸降低UCP2表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)，UCP2反義寡核苷酸(濃度10μmol/L)組，UCP2錯(cuò)義寡核苷酸(濃度10μmol/L)組，然后用外源性解偶聯(lián)劑增加內(nèi)皮細(xì)胞解偶聯(lián)活性，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)，An

4、gⅡ1μmol/L組，CLCCP(100μmol/L)+AngⅡ1μmol/L組，助溶劑DMSO100μumol/L+AngⅡ1μmol/L組，分別與HUVEC共培養(yǎng)24小時(shí)，DCFH-DA檢測(cè)線粒體活性氧，羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位。 (3)觀察氧化劑對(duì)UCP2的影響，實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)，H2O2100μmol/L組，H2O250μmol/L組與HUVECs共培養(yǎng)24小時(shí)，RT-PCR法定量UCP2mRNA表

5、達(dá)。 結(jié)果：用10μmol/L，1μmol/L，0.1μmol/L的AngⅡ處理HUVEC24小時(shí)后: 1)流式細(xì)胞儀測(cè)線粒體膜電位(羅丹明123染色)的平均熒光強(qiáng)度分別為418.1±5.8，354.1±4.2，267.6±10.6。流式細(xì)胞儀測(cè)活性氧(DCFH-DA法)的平均熒光強(qiáng)度是365.3±5.2，258.2±4.8，188.6±12.6。 2)UCP2mRNA表達(dá)(灰度值)分別是0.450±0.024，

6、0.436±0.018，0.381±0.020，1μmol/L組比0.1μmol/L組表達(dá)增加極顯著,10μmol/L組比1μmol/L組表達(dá)增加顯著，即UCP2隨AngⅡ的濃度升高而表達(dá)增加；用UCP2反義寡核苷酸(濃度10微摩爾/升)與HUVEC共培養(yǎng)24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，活性氧升高83％，線粒體膜電位升高64％，CLCCP(濃度100微摩爾/升)與HUVEC共培養(yǎng)24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，活性氧下降26％，線粒體膜電位下降28

7、％。此外用濃度為100微摩爾/升和50微摩爾/升的H2O2干預(yù)HUVECs24小時(shí)，UCP2mRNA表達(dá)為0.412±0.026和0.393±0.018，50μmol/L兒組比對(duì)照組表達(dá)增加極顯著，100gmo兒組比50μmol/L組表達(dá)增加顯著，即UCP2隨H202的濃度升高而表達(dá)增加。 結(jié)論：AngⅡ增加線粒體活性氧的產(chǎn)生，上調(diào)UCP2的表達(dá)；降低UCP2的表達(dá)使活性氧生成增加，增加線粒體解偶聯(lián)活性(CLCCP)使線粒體活性