腎上腺素能信號(hào)調(diào)控腫瘤血管生成的機(jī)制研究.pdf

1、血管生成是腫瘤賴以生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。在正常生理?xiàng)l件下，新生血管的形成受體內(nèi)調(diào)控機(jī)制的嚴(yán)格控制。與此相反，在腫瘤組織中，血管生成過程失控。一旦新生血管形成的程序啟動(dòng)，此過程將無限期持續(xù)。腫瘤血管生成是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，眾多的血管生成調(diào)控因子以及多條信號(hào)通路參與該過程的調(diào)控。近年來的研究結(jié)果表明，Notch信號(hào)通路在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮重要的作用。
　　應(yīng)激反應(yīng)(stress)是指機(jī)體受到有害刺激（如創(chuàng)傷、手術(shù)、失血、感染、中毒、

2、缺氧、饑餓、抑郁、焦慮等）時(shí)，產(chǎn)生的一系列非特異性的心理與生理反應(yīng)。機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸活動(dòng)增強(qiáng)，從而引起機(jī)體內(nèi)多種應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)激素（例如兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素等）的水平發(fā)生變化。最近的研究揭示，應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)激素兒茶酚胺在腫瘤新生血管形成過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，慢性束縛應(yīng)激可導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)兒茶酚胺（腎上腺素或去甲腎上腺素）水平升高，并可顯著增加小鼠卵巢癌移植瘤組織中的血管密度。我們的

3、研究以及其它研究小組的工作證實(shí)，兒茶酚胺可在多種腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管形成，而β-腎上腺素能受體(β-AR)阻滯劑能有效逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的血管形成，提示兒茶酚胺和β-AR介導(dǎo)的信號(hào)通路與腫瘤血管生成密切相關(guān)。然而，兒茶酚胺和β-AR信號(hào)通路活化調(diào)控腫瘤血管生成的分子機(jī)制尚不完全清楚。
　　在本項(xiàng)研究中，我們揭示了兒茶酚胺調(diào)控腫瘤血管生成的一個(gè)新機(jī)制，即兒茶酚胺激活β2-AR-PKA-mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)乳

4、腺癌細(xì)胞Jagged-1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活與腫瘤細(xì)胞相鄰的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch信號(hào)通路活化，從而促進(jìn)了腫瘤新生血管生成。主要的研究結(jié)果如下。
　　1.兒茶酚胺通過旁分泌非依賴性途徑誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成。應(yīng)用去甲腎上腺素(NE)刺激乳腺癌細(xì)胞系MDA-453，在刺激后不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，通過半定量RT-PCR法分析NE誘導(dǎo)VEGF mRNA表達(dá)水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NE可顯著增強(qiáng)MDA-453細(xì)胞的VEGF

5、表達(dá)。收集經(jīng)NE刺激的MDA-453細(xì)胞的培養(yǎng)上清，用以處理人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC。通過體外血管形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NE刺激后的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清可顯著增強(qiáng)HUVEC形成血管樣結(jié)構(gòu)，提示NE可能通過刺激腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF、以旁分泌的形式調(diào)控腫瘤血管生成。有趣的是，當(dāng)我們將MDA-453細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)NE可更為有效地促進(jìn)HUVEC形成血管樣結(jié)構(gòu)，且血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量和結(jié)構(gòu)的完整性均明顯超過腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的作用。我們又以乳

6、腺癌細(xì)胞細(xì)胞系MCF-7和MDA-231為模型細(xì)胞，亦獲得了相似的結(jié)果，提示兒茶酚胺除通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)、產(chǎn)生旁分泌形式的促血管生成效應(yīng)外，其它途徑亦參與了NE誘導(dǎo)的腫瘤血管形成過程。
　　2.兒茶酚胺調(diào)控乳腺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間Jagged-1/Notch信號(hào)。我們用Notch報(bào)告載體pGA981-6轉(zhuǎn)染HUVEC。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)，并在混合培養(yǎng)體系中加入NE刺激。應(yīng)用雙熒光素酶活性測定分析了NE刺激對(duì)HUV

7、EC中Notch活化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NE刺激對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)的HUVEC中Notch報(bào)告基因活性不產(chǎn)生明顯的影響。而當(dāng)HUVEC與MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，NE則可顯著地誘導(dǎo)HUVEC中Notch報(bào)告基因的活性。我們又在乳腺癌細(xì)胞系MDA-453中對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，NE誘導(dǎo)HUVEC中Notch活化依賴于腫瘤細(xì)胞的存在，推測NE可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)Notch受體的配體，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch信號(hào)通路活化。因此，

8、我們應(yīng)用兒茶酚胺刺激多種乳腺癌細(xì)胞，通過Western blot分析了細(xì)胞中Notch配體的表達(dá)。結(jié)果顯示，兒茶酚胺可在多種乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)Notch配體Jagged-1表達(dá)。敲低乳腺癌細(xì)胞中Jagged-1的表達(dá)可顯著抑制NE誘導(dǎo)的HUVEC中Notch的活化。這些結(jié)果提示，兒茶酚胺可能通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間Jagged-1/Notch信號(hào)，從而影響腫瘤血管形成。
　　3.兒茶酚胺通過激活乳腺癌細(xì)胞中β2-AR-PK

9、A-mTOR信號(hào)通路上調(diào)Jagged-1的表達(dá)。我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法，檢測了兒茶酚胺誘導(dǎo)后乳腺癌細(xì)胞中Jagged-1 mRNA表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在多種乳腺癌細(xì)胞中，兒茶酚胺均可在轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)Jagged-1的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦證實(shí)，異丙腎上腺素(ISO)慢性刺激可顯著誘導(dǎo)移植瘤組織中Jagged-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。同時(shí)，ISO慢性刺激組的移植瘤組織中，CD31陽性的血管結(jié)構(gòu)顯著增多。應(yīng)用JAG1啟

10、動(dòng)子報(bào)告載體和雙熒光素酶活性測定，觀察到NE可通過增強(qiáng)AG-1啟動(dòng)子活性，上調(diào)Jagged-1 mRNA的表達(dá)。β2-AR、PKA及mTOR特異性抑制劑均可有效抑制NE誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞Jagged-1表達(dá)上調(diào)，表明β2-AR-PKA-mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)了兒茶酚胺誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞中Jagged-1表達(dá)上調(diào)。
　　4.兒茶酚胺通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間Jagged-1/Notch信號(hào)，調(diào)控腫瘤血管生成。應(yīng)用NE刺激MDA-453

11、細(xì)胞后，用無酶消化液消化并收集細(xì)胞，將其與HUVEC共培養(yǎng)，進(jìn)行體外血管生成實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NE刺激的MDA-453細(xì)胞能強(qiáng)有力地促進(jìn)HUVEC血管樣結(jié)構(gòu)形成。而且，NE刺激的MDA-453細(xì)胞可更為顯著地激活HUVEC中Notch信號(hào)通路的活化。我們又以乳腺癌細(xì)胞MDA-231細(xì)胞為模型對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了驗(yàn)證，獲得了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Jagged-1在血管形成中的作用，我們?cè)谌橄侔┘?xì)胞中過表達(dá)Jagged-1，并將過表達(dá)

12、Jagged-1的乳腺癌細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)Jagged-1的乳腺癌細(xì)胞可顯著促進(jìn)血管生成;而在乳腺癌細(xì)胞中敲低Jagged-1的表達(dá)，不僅可抑制NE誘導(dǎo)的HUVEC中Notch信號(hào)通路的活化，而且可顯著抑制NE誘導(dǎo)的HUVEC血管樣結(jié)構(gòu)形成。
　　綜上所述，本研究首次報(bào)道:1.兒茶酚胺可通過乳腺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸依賴途徑促進(jìn)腫瘤血管形成;2.在乳腺癌細(xì)胞中，兒茶酚胺激活β2-AR-PKA-mTOR信