基于VEGF--A的田薊苷抗腫瘤血管生成作用及機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類(lèi)死亡的主要原因之一。惡性腫瘤的起源不是血管生成，但當(dāng)腫瘤體積生長(zhǎng)至2-3mm3，腫瘤必須誘導(dǎo)新的血管生長(zhǎng)供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)，否則其將無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。然而，大多數(shù)已在臨床使用的抗血管生成制劑的副作用及其昂貴的價(jià)格限制了它們的長(zhǎng)期使用。因此價(jià)格相對(duì)適中、靶向血管新生的新藥急需發(fā)現(xiàn)。
　　黃酮類(lèi)藥物普遍具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤的作用。維吾爾族民族用藥香青蘭含有數(shù)十種黃酮活性成分，主要用于治療呼吸道疾病、神經(jīng)衰弱、焦慮等。田薊苷(

2、Tilianin，TIL)是從香青蘭中提取的主要活性成分之一。已有研究表明，田薊苷可抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移;抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路;下調(diào)EGFR-MEK-Erk和Akt信號(hào)通路;抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的VCAM-1表達(dá)等。本課題研究的目的是考察田薊苷是否具有腫瘤抑制及血管生成抑制作用并揭示其特點(diǎn)，闡明其作用機(jī)制。
　　本課題的第一部分通過(guò)構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌荷瘤小鼠模型，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上考察不同劑量田薊苷對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑

3、制情況。結(jié)果顯示，低劑量田薊苷無(wú)明顯抑制腫瘤的作用，而高劑量田薊苷可顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)。
　　本課題的第二部分通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)田薊苷進(jìn)行了體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，以A549和HUVECs為目標(biāo)細(xì)胞，結(jié)果顯示10-160μM田薊苷在24h和48h時(shí)，對(duì)HUVECs增殖抑制率分別為4.07％-55.86％，8.76％-65.34％，IC50值分別為140μM和102.3μM。VEGF-A顯著誘導(dǎo)HUVECs增殖(P＜0.05)，1

4、0-160μM田薊苷在24h對(duì)HUVECs的抑制率為4.26％-77.33％，在48h為5.95％-81.91％，IC50分別為105.2μM(24h)和85.5μM(48h)。而田薊苷在更高的濃度下才可顯著抑制A549增殖，其IC50分別為557μM(24h)和310.6μM(48h)。這些結(jié)果表明，HUVECs對(duì)田薊苷更為敏感，田薊苷對(duì)腫瘤的抑制作用可能與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖從而抑制血管生成有關(guān)。
　　本課題的第三部分通過(guò)體外

5、VEGF-A誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、小管生成模型考察田薊苷在體外對(duì)血管生成主要過(guò)程的干預(yù)作用;通過(guò)VEGF-A誘導(dǎo)的體內(nèi)血管生成模型考察田薊苷對(duì)體內(nèi)血管新生的影響。結(jié)果顯示，10-40μM田薊苷可以抑制47.21％-87.15％VEGF-A誘導(dǎo)的HUVECs遷移。田薊苷以濃度依賴(lài)的方式阻滯VEGF-A誘導(dǎo)的體外小管形成，10μM田薊苷可抑制40％以上的小管形成，40μM田薊苷幾乎可完全抑制管腔形成。田薊苷不僅可以抑制新的小管形成，而且可

6、以破壞已經(jīng)形成的小管。與陰性對(duì)照組相比，VEGF-A可誘導(dǎo)體內(nèi)基質(zhì)膠內(nèi)血管生成，而田薊苷干預(yù)組可顯著逆轉(zhuǎn)此作用:VEGF-A誘導(dǎo)組基質(zhì)膠中微血管密度是陰性對(duì)照組的九倍左右，田薊苷干預(yù)組基質(zhì)膠中的微血管密度與VEGF-A誘導(dǎo)組相比下降了8倍左右。將第一部分實(shí)驗(yàn)中各組腫瘤組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織免疫組化CD31染色結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，高劑量田薊苷實(shí)驗(yàn)組CD31表達(dá)顯著降低，腫瘤組織內(nèi)微血管密度低于對(duì)照組。各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組

7、織Tunel熒光結(jié)果分析顯示，高劑量田薊苷實(shí)驗(yàn)組凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯高于其他兩組。
　　本課題的第四部分通過(guò)western blotting研究田薊苷抑制血管生成的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，40μM田薊苷可顯著抑制HUVECs中VEGF-A誘導(dǎo)的VEGFR2、Akt和Erk1/2的磷酸化。40μM田薊苷可顯著抑制A549細(xì)胞中VEGF-A、p-Akt、HIF-1α的表達(dá);40μM田薊苷也可顯著減少缺氧條件下A549腫瘤細(xì)胞中HIF-1α蛋白