作用于電壓門(mén)控鈉離子通道的信號(hào)芋螺毒素的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、芋螺是生活在熱帶海域淺水區(qū)的肉食性的海洋軟體動(dòng)物。它們利用毒液中雞尾酒樣的混合毒素捕食、防御和競(jìng)爭(zhēng)。芋螺毒素能特異地作用于神經(jīng)系統(tǒng)的電壓門(mén)控和配體門(mén)控離子通道的不同亞型和遞質(zhì)受體，因而被廣泛用作神經(jīng)生物學(xué)研究的離子通道和受體研究工具藥物，有些被直接開(kāi)發(fā)成臨床藥物和診斷試劑。本文以中國(guó)南海食蟲(chóng)性信號(hào)芋螺(Conus litteratus)為研究對(duì)象，采用凝膠過(guò)濾、離子交換層析和高效液相色譜的方法從信號(hào)芋螺毒管中分離純化新的芋螺多肽。在此基

2、礎(chǔ)上，利用蛋白質(zhì)化學(xué)以及電生理的技術(shù)和手段展開(kāi)了一系列的研究工作。 從信號(hào)芋螺毒液中純化了一種新的芋螺毒素。N-端測(cè)序表明，這種新的芋螺毒素由12個(gè)氨基酸殘基組成，含有4個(gè)半胱氨酸，屬于T-超家族芋螺毒素。經(jīng)與信號(hào)芋螺毒管cDNA文庫(kù)比較，發(fā)現(xiàn)是由Lt5.4(DQ345353)基因編碼的，所以命名為lt5d。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，以全細(xì)胞記錄的方法，檢測(cè)了lt5d對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞電壓門(mén)控Na<'+>通道的影響。發(fā)現(xiàn)nM級(jí)的lt5

3、d就能有效抑制TTX敏感型Na<'+>通道，而對(duì)TTX不敏感型Na<'+>通道則沒(méi)有影響。lt5d部分抑制鈉電流后，電流的形狀和對(duì)照電流形狀一致，說(shuō)明它們沒(méi)有明顯改變TTX敏感型鈉電流的激活與失活相動(dòng)力學(xué)特征，推斷l(xiāng)t5d可能結(jié)合鈉通道位點(diǎn)1。lt5d抑制TTX敏感型鈉電流具有濃度依從性，其半數(shù)有效抑制濃度(IC<,50>)為156．16nM。根據(jù)lt5d的模擬結(jié)構(gòu)，推測(cè)lt5d的Lys 6可能是與鈉離子通道相互作用的關(guān)鍵殘基。首次發(fā)現(xiàn)

4、了T-超家族芋螺毒素能阻斷哺乳動(dòng)物感覺(jué)神經(jīng)元上的電壓門(mén)控Na<'+>通道。 從信號(hào)芋螺毒液中分離純化了兩種P-超家族芋螺毒素lt9a和lt9b。這兩種毒素具有相同的半胱氨酸骨架，對(duì)照信號(hào)芋螺毒管cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)它們是由同一基因Lt9.1編碼的，成熟肽的氨基酸序列也是相同的，只是具有不同的翻譯后修飾。研究表明，lt9b是lt9a經(jīng)Pro<'12>、Pro<'17>羥基化和Glu<'21>γ-羧化后的產(chǎn)物。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對(duì)兩

5、種新的P-超家族信號(hào)芋螺毒素進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn)，500 nM的lt9a對(duì)TTX敏感型鈉電流有明顯作用，能夠增大細(xì)胞內(nèi)向鈉電流，與對(duì)照組相比，增加了38.86±1.31％(n=3)，lt9a：t曾大TTX敏感型鈉電流具有濃度依從性。在該濃度毒素作用下，DRG細(xì)胞鈉電流與電壓的依賴關(guān)系和鈉通道的激活電位沒(méi)有改變，而翻轉(zhuǎn)電位從+20 mV改變?yōu)?30mV。使用單指數(shù)擬合的方法對(duì)毒素作用前后鈉通道在最大激活電壓-20mV下的最大開(kāi)放曲線進(jìn)行擬合，

6、毒素作用后鈉通道開(kāi)放時(shí)間與對(duì)照組相比延長(zhǎng)了約30.5％(n=3)。與lt9a的作用不同，500 nM的lt9b對(duì)TTX敏感型鈉電流有明顯抑制作用，最大抑制率為49.60±2.61％(n=3)。lt9b部分抑制鈉電流后，電流的形狀和對(duì)照電流形狀一致，說(shuō)明它沒(méi)有明顯改變TTX敏感型鈉電流的激活與失活相動(dòng)力學(xué)特征。lt9b抑制TTx敏感型鈉電流具有濃度依從性，其半數(shù)有效抑制濃度(IC<,50>)為504.04nM。首次發(fā)現(xiàn)了P-超家族芋螺毒素

7、能作用于電壓門(mén)控鈉離子通道。從信號(hào)芋螺(C litterarus)毒管cDNA表達(dá)文庫(kù)EST序列分析中發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼典型芋螺毒素前體肽結(jié)構(gòu)的cDNA序列，成熟肽區(qū)含有4個(gè)半胱氨酸，且排布方式不同于已經(jīng)發(fā)表的任何一類半胱氨酸骨架，根據(jù)現(xiàn)有的芋螺毒素命名原則，我們將這一種新類型的骨架命名為骨架XVI，該新的芋螺毒素被命名為ltl6a。我們利用基因工程手段，采用了pMAL-p2x表達(dá)系統(tǒng)將Lt16.1成熟肽編碼序列轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行了融合表達(dá)，最

8、終獲得了高純度的重組毒素蛋白。利用飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)重組蛋白進(jìn)行物理性質(zhì)的鑒定，結(jié)果顯示毒素蛋白的分子量與預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。同時(shí)，膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重組毒素可以阻斷電壓敏感型鈉通道而不改變通道的激活與失活的動(dòng)力學(xué)曲線。 本項(xiàng)研究從我國(guó)南海信號(hào)芋螺中發(fā)現(xiàn)并分離出了3種新的芋螺毒素，融合表達(dá)了一種具有新的半胱氨酸骨架的芋螺毒素，進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能研究。它們有不同的結(jié)構(gòu)，以不同的方式作用于電壓門(mén)控鈉離子通道，它們展示了芋螺毒素在分子水平的生