東亞鉗蝎毒素對(duì)神經(jīng)元離子通道作用的研究.pdf

1、第一部分：東亞鉗蝎毒素的分離純化和性質(zhì)鑒定 應(yīng)用經(jīng)典色譜的方法分離純化東亞鉗蝎毒素，經(jīng)過柱層析(SephadexG-25，SephadexG-50，CM Sephadex C-25)得到六個(gè)粗毒組分(BmK221-226)，再通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)最終獲得兩個(gè)多肽：BmK2255和BmK2256。 運(yùn)用ESI-MS對(duì)兩個(gè)多肽的分子量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示BmK2255的分子量為7223.0Da，BmK2256

2、分子量為7036.85Da，且均為單一性多肽。Edman降解測(cè)序法結(jié)果顯示BmK2255的全長(zhǎng)序列為VRDGYIADDK NCAYF CGRNA YCDEE CIING AESGY CQQAG VYGNACWCYK LPDKv PIRVS GECQQ，與已發(fā)現(xiàn)的bukatoxin(BKTx)的氨基酸序列一致；BmK 2256(暫定名為BmKNJX11)的前15個(gè)氨基酸殘基序列為GRDAY IADSE NCTYT，與已發(fā)現(xiàn)的Makatox

3、in Ⅰ和BmK 9(3)-2前15個(gè)氨基酸殘基完全一致。 第二部分：東亞鉗蝎毒素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)動(dòng)作電位的作用 以大鼠背根神經(jīng)節(jié)DRG神經(jīng)元為標(biāo)本，運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在電流鉗記錄模式下，成功記錄到了動(dòng)作電位(AP)后，加入了鈉通道特異性阻斷劑河豚毒素(TTX)，結(jié)果顯示AP的發(fā)放頻率和幅值被明顯抑制，用外液沖洗后部分恢復(fù)。在此基礎(chǔ)上研究了bukatoxin和BmKNJX11對(duì)AP的作用，發(fā)現(xiàn)20，40μg/ml bu

4、katoxin和BmKNJX11均使單個(gè)AP的時(shí)程延長(zhǎng)，幅值減小，80μg/ml bukatoxin和BmKNJX11使DRG神經(jīng)元幾乎不發(fā)放動(dòng)作電位。 第三部分：東亞鉗蝎毒素對(duì)神經(jīng)元鈉通道的作用 以大鼠DRG神經(jīng)元為標(biāo)本，研究了BmKNJX11對(duì)TTX敏感型(TTX-S)和TTX非敏感型(TTX-R)鈉電流(INa)的作用。結(jié)果表明：BmKNJX11以濃度依賴和電壓依賴的方式抑制TTX-S INa和TTX-R INa。

5、40μg/ml BmKNJX11使TTX-S INa激活曲線和失活曲線均向超極化方向移動(dòng)，衰減時(shí)間常數(shù)τ變大，復(fù)活時(shí)間延長(zhǎng)，可激活通道數(shù)目減少，使TTX-R INa激活曲線向去極化方向移動(dòng)，失活曲線向超級(jí)化方向移動(dòng)，衰減時(shí)間常數(shù)τ變大，復(fù)活時(shí)間延長(zhǎng)，可激活通道數(shù)目減少，這可能是導(dǎo)致DRG神經(jīng)元興奮性降低，動(dòng)作電位發(fā)放頻率和幅值減小的原因。 采用Real-Time RT-PCR技術(shù)分別研究bukatoxin對(duì)PC12細(xì)胞鈉通道亞型

6、Nav1.3和Nav1.8 mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)，bukatoxin預(yù)處理30min后，PC12細(xì)胞Nav1.3 mRNA的表達(dá)增高，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Nav1.3 mRNA表達(dá)下降；而Nav1.8 mRNA的表達(dá)下降，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Nav1.8 mRNA表達(dá)下降得更加明顯，但7hr時(shí)Nav1.8mRNA表達(dá)有所回升。 第四部分：東亞鉗蝎毒素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)鉀通道的作用 以大鼠DRG神經(jīng)元為標(biāo)本，運(yùn)用膜片鉗技術(shù)研究

7、了bukatoxin和BmKNJX11對(duì)電壓門控鉀離子通道的作用。結(jié)果表明：80μg/mlbukatoxin對(duì)全鉀電流(IK)、延遲整流鉀電流(IKDR)、瞬時(shí)外向鉀電流(IA)無明顯作用；80 μg/ml BmKNJX11對(duì)IK(主要成分為IKDR和IA)有輕微的抑制作用，使IA減小至加藥前的85.34±1％，IKDR減小至加藥前的78.124±2％。 第五部分：東亞鉗蝎毒素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)GABAA受體的作用 運(yùn)用全

8、細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在急性分離的大鼠DRG申經(jīng)元上依次加入1-1000 μmol/L GABA誘導(dǎo)出一內(nèi)向電流，該電流隨著GABA濃度增大而增大，且在-100～0 mV范圍內(nèi)為負(fù)向電流，在0～+40 mV范圍內(nèi)為正向電流，翻轉(zhuǎn)電位為0 mV，表明該電流具有濃度依賴性，且在-100 mV～+40 mV內(nèi)具有電壓依賴性。在記錄到穩(wěn)定的IGABA后，加入GABAA受體的特異性拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline，Bie)，電流明顯被抑制，而加入

9、特異性激動(dòng)劑四氫吡啶甲酸(isoguvacine，Iso)后，電流明顯增大，證明所記錄到的電流為GABA激活電流。 在建立了配體門控離子通道記錄方法的基礎(chǔ)上，研究了bukatoxin和BmKNJX11對(duì)GABA激活電流的作用。結(jié)果顯示bukatoxin對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元IGABA有濃度依賴性的抑制作用，半數(shù)抑制濃度(IC50)為42.26 μg/ml，Hill系數(shù)(h)為2.01。BmKNJX11對(duì)IGABA有濃度依賴性的興奮作