ψ-芋螺毒素MⅦA的表達與純化.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文ψ芋螺毒素MⅦA的表達與純化姓名：陳小穎申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：詹金彪20040501浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文陳小顳整片段，插入經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶酶切后的原核表達載體pET32a()。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ct。挑取轉(zhuǎn)化菌落，分別抽提質(zhì)粒，經(jīng)DNA酶切、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)小量誘導(dǎo)表達、質(zhì)粒測序三步鑒定重組質(zhì)粒的DNA序列。將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒pET32a()一CTX轉(zhuǎn)化感

2、受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達Trx／CTX融合蛋白。超聲破菌后取上清液及沉淀分別經(jīng)SDSPAGE電泳檢查，表明融合蛋白幾乎都是可溶性的，存在于上清中，故取上清純化。利用融合蛋白中的6xHisTag，采用金屬螫合親和層析方法(Cu—IDA樹脂)純化融合蛋白，經(jīng)凝膠過濾除鹽，將各次處理的產(chǎn)物分別取樣用SDSPAGE驗證含量及純度，最后合并純度較高的樣品用RP—HPLC(Reversephasehigh—performa

3、nceliquidchromatography)鑒定。由于融合蛋白中吉多個Cys殘基，而目的蛋白CTX的生物學(xué)活性決定于它所含的三對二硫鍵的正確配對，故先在純化產(chǎn)物中加入一定濃度的巰基乙醇(13一mercaptoethanol，BME)，還原所有可能形成的二硫鍵，然后在一定的鹽濃度下透析去除蛋白液中的BME，緩漫空氣氧化使之配對形成天然結(jié)構(gòu)的二硫鍵。經(jīng)還原氧化處理后的融合蛋白，采用經(jīng)典的小鼠熱板鎮(zhèn)痛實驗鑒定其生物學(xué)活性?！窘Y(jié)果l目的基因

4、與載體基因連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5c‘后，挑取菌落分別抽提質(zhì)粒篩選鑒定。DNA酶切重組質(zhì)粒證實有小片段基因插入，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌，經(jīng)小量誘導(dǎo)表達出符合預(yù)計分子量的融合蛋白，DNA測序證實(J)CTXMVIIA基因序列按預(yù)計方案正確插入原核表達載體pET32a()。經(jīng)測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)大量表達Trx／CTX融合蛋白，SDSPAGE可見其分子量(Mw)約197KD符合預(yù)計值，表達量約占細菌總蛋白