應(yīng)用多肽毒素探針研究離子通道的結(jié)構(gòu)和功能.pdf

1、專一性作用于電壓門控鈉離子通道的天然多肽毒素可作為研究通道結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的分子探針。
　　本研究從雷氏大疣蛛和敬釗纓毛蛛毒液中分別鑒定到了兩個(gè)新的小分子多肽:作用于鈉通道亞型Nav1.3的RTX-Ⅶ和作用于細(xì)菌鈉離子通道的JZTX-27。利用兩個(gè)多肽毒素作為分子探針，我們分別對Nav1.3通道晚期鈉電流的形成機(jī)制以及細(xì)菌鈉通道上的保守神經(jīng)毒素作用位點(diǎn)作了深入的探討。
　　在本文的第二章，我們利用RTX-Ⅶ作為分子探針研究了N

2、av1.3通道的四個(gè)結(jié)構(gòu)域在晚期鈉電流產(chǎn)生中的作用。RTX-Ⅶ是一個(gè)35個(gè)氨基酸殘基的小分子多肽，MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定RTX-Ⅶ的分子量為4072.68 Da，RTX-Ⅶ序列中的8個(gè)半胱氨酸按1-4，2-5，6-7，3-8的連接模式形成四對二硫鍵。對各哺乳動(dòng)物鈉通道亞型進(jìn)行活性分析發(fā)現(xiàn)RTX-Ⅶ強(qiáng)烈抑制Nav1.3通道和海馬神經(jīng)元鈉通道的快失活，誘導(dǎo)通道產(chǎn)生大的晚期鈉電流。但高濃度RTX-Ⅶ對Nav1.4，Nav1.5，Nav1.

3、7通道和DRG TTX-R鈉通道的電流都沒有影響。提示RTX-Ⅶ具有較好的鈉通道亞型選擇性。RTX-Ⅶ濃度依賴性的誘導(dǎo)Nav1.3通道的晚期鈉電流，其半數(shù)有效濃度(EC50)約為120 nM。毒素結(jié)合到Nav1.3通道和毒素從Nav1.3通道上的洗脫都較慢，其結(jié)合時(shí)間常數(shù)和洗脫時(shí)間常數(shù)分別為40.9±11.3 s和162.8±39.7 s。
　　I-V曲線顯示RTX-Ⅶ在低電壓下易化Nav1.3通道的激活，在較強(qiáng)去極化電壓下不影響

4、通道的峰電流。毒素處理后Nav1.3通道的峰電流和晚期鈉電流具有相同的激活動(dòng)力學(xué)。RTX-Ⅶ使Nav1.3通道的激活動(dòng)力學(xué)向超極化方向漂移，對通道失活的電壓依賴性不產(chǎn)生影響，但毒素在失活曲線上誘導(dǎo)了一個(gè)穩(wěn)態(tài)成分。與許多Alpha蝎毒類似，RTX-Ⅶ與Nav1.3通道相互作用表現(xiàn)出電壓依賴性的解離和重新結(jié)合。RTX-Ⅶ從Nav1.3通道上解離具有電壓和時(shí)間依賴性，而毒素重新結(jié)合到Nav1.3通道上只具有時(shí)間依賴性。毒素基本不影響Nav1.

5、3通道的失活后恢復(fù)動(dòng)力學(xué)。
　　RTX-Ⅶ抑制海馬神經(jīng)元鈉通道的失活提示毒素可能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)超興奮，小鼠側(cè)腦室注射毒素證實(shí)了這一假設(shè)。隨后我們以Nav1.3通道和海馬神經(jīng)元鈉通道作為模型研究了RTX-Ⅶ引起小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性中毒的原因。RTX-Ⅶ激活了Nav1.3通道在不同速率的斜坡電壓下的電流，并導(dǎo)致斜坡電流第一個(gè)峰向超極化方向漂移。同時(shí)，我們的研究發(fā)現(xiàn)RTX-Ⅶ同步增強(qiáng)Nav1.3通道的晚期鈉電流和斜坡電流的第二個(gè)峰，

6、這兩種電流成分存在緊密的線性相關(guān)性(R2=0.998)，RTX-Ⅶ激活Nav1.3通道斜坡電流第二個(gè)峰的半數(shù)有效濃度(EC50)約為0.3μM。RTX-Ⅶ對海馬神經(jīng)元鈉通道的斜坡電流產(chǎn)生了與對Nav1.3通道的斜坡電流類似的影響，包括增強(qiáng)斜坡電流的幅度以及誘導(dǎo)斜坡電流的第一個(gè)峰向超極化方向顯著的漂移。在毒素誘導(dǎo)下海馬神經(jīng)元鈉通道斜坡電流的第二個(gè)峰的電流幅度只與跨膜電位相關(guān)。毒素對通道斜坡電流的影響強(qiáng)烈提示毒素處理使神經(jīng)元自發(fā)性爆發(fā)動(dòng)作電

7、位。電流鉗實(shí)驗(yàn)證實(shí)RTX-Ⅶ誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元靜息狀態(tài)下爆發(fā)動(dòng)作電位導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性中毒。
　　RTX-Ⅶ不能誘導(dǎo)Nav1.5通道產(chǎn)生晚期鈉電流。通過同源重組將Nav1.3全部四個(gè)結(jié)構(gòu)域的電壓敏感元件和孔道區(qū)替換成Nav1.5通道的相應(yīng)區(qū)域，我們研究了Nav1.3通道各結(jié)構(gòu)域在晚期鈉電流產(chǎn)生中的作用。Nav1.3通道的第二結(jié)構(gòu)域和第四結(jié)構(gòu)域孔道區(qū)的替換顯著降低通道在毒素誘導(dǎo)下產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)晚期鈉電流，但不影響毒素對通道的表觀親和力

8、。Nav1.3通道第四結(jié)構(gòu)域電壓敏感元件的替換顯著改變毒素對通道的結(jié)合，Nav1.3通道第一結(jié)構(gòu)域孔道區(qū)的替換不影響通道在毒素誘導(dǎo)下產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)晚期鈉電流幅度但較小程度的改變了毒素對通道的親和力，提示RTX-Ⅶ結(jié)合在Nav1.3通道神經(jīng)毒素作用位點(diǎn)3。競爭性實(shí)驗(yàn)表明RTX-Ⅶ不與HNTX-Ⅲ競爭Nav1.3通道上的神經(jīng)毒素作用位點(diǎn)4，對位點(diǎn)3進(jìn)行單點(diǎn)突變掃描證實(shí)該區(qū)域的多個(gè)氨基酸殘基參與毒素的結(jié)合。
　　將Nav1.3通道的四個(gè)結(jié)構(gòu)

9、域分別重構(gòu)至Nav1.5通道顯示只有結(jié)構(gòu)域四的替換才能回復(fù)毒素對嵌合體通道的活性，將Nav1.3通道的全部四個(gè)結(jié)構(gòu)域重構(gòu)至Nav1.5通道構(gòu)建了四重嵌合體通道1.5/1.3DⅠ-DⅡ-DⅢ-DⅣ chimera，RTX-Ⅶ能夠誘導(dǎo)該四重嵌合體通道產(chǎn)生與野生型Nav1.3通道幅度相當(dāng)?shù)姆€(wěn)態(tài)晚期鈉電流。隨后將Nav1.3通道的第四結(jié)構(gòu)域和其他三個(gè)結(jié)構(gòu)域按不同組合重構(gòu)至Nav1.5通道證實(shí)只需將Nav1.3通道的第二和第四結(jié)構(gòu)域重建至Nav1

10、.5通道即可使嵌合體通道在毒素誘導(dǎo)下產(chǎn)生與野生型Nav1.3通道幅度相當(dāng)?shù)姆€(wěn)態(tài)晚期鈉電流。
　　本論文的第三章研究了從敬釗纓毛蛛中分離純化的JZTX-27與細(xì)菌鈉離子通道NsvBa的相互作用。JZTX-27序列全長34個(gè)氨基酸殘基，分子量4086.81Da，包含6個(gè)半胱氨酸，也是一個(gè)抑制劑胱氨酸結(jié)(ICK)多肽。在-20 mV的去極化電壓下，JZTX-27強(qiáng)烈抑制NsvBa通道的峰電流。然而，高濃度的JZTX-27(10μM)對另

11、外兩個(gè)細(xì)菌鈉離子通道NavPz和NavSp的峰電流抑制較少或沒有抑制。JZTX-27抑制NsvBa通道峰電流具有濃度依賴性，在去極化電壓為-20 mV時(shí)毒素抑制NsvBa通道峰電流的半數(shù)抑制濃度(IC50)為112 nM。JZTX-27結(jié)合到NsvBa通道上非常快(τon=3.1±1.58 s)但其洗脫相對較慢(τoff=41.8±5.4 s)。
　　與許多beta蜘蛛毒素類似，JZTX-27抑制NsvBa通道的峰電流具有電壓依賴

12、性。在較低的毒素（0.2μM）濃度下，JZTX-27不抑制通道的外向電流。電壓-峰電流抑制率曲線顯示0.2μM JZTX-27對NsvBa峰電流的抑制發(fā)生在較負(fù)的電壓范圍，整條曲線呈鐘形。在-20mV，0mV和+20mV的去極化電壓下JZTX-27抑制NsvBa通道峰電流的半數(shù)抑制劑量(IC50)分別為112 nM，426 nM和645 nM。0.2μMJZTX-27使NsvBa通道的激活曲線向去極化方向漂移，但對通道的穩(wěn)態(tài)失活不產(chǎn)生明

13、顯的影響。
　　JZTX-27與NsvBa通道作用的動(dòng)力學(xué)顯示毒素減慢了通道的激活但加速了通道的去激活過程。在去極化電壓+100mV至+200mV的范圍內(nèi)，1.5μM JZTX-27顯著減慢通道的激活并且結(jié)合了毒素的NsvBa通道表現(xiàn)出電壓依賴性的激活。對照組NsvBa通道的尾電流在-200mV至-100mV的電壓范圍內(nèi)表現(xiàn)出電壓依賴性的衰減。1.5μMJZTX-27顯著加快了通道在上述電壓范圍內(nèi)的去激活并基本消除了這種電壓依賴性

14、。我們推測JZTX-27將NsvBa通道穩(wěn)定在了靜息狀態(tài)。
　　10μM JZTX-27對NavPz通道的峰電流影響很小，將NsvBa通道的S3-S4胞外環(huán)替換成NavPz通道的相應(yīng)區(qū)域顯著降低毒素對通道的親和力。相反的，將NavPz通道的S3-S4胞外環(huán)替換成NsvBa通道的相應(yīng)區(qū)域使通道對JZTX-27變得敏感，5μM JZTX-27完全抑制嵌合體通道的峰電流。對該區(qū)域進(jìn)行單點(diǎn)突變掃描顯示NsvBa通道S3-S4胞外連接環(huán)第9

15、9位纈氨酸是毒素與通道相互作用的關(guān)鍵殘基。對NsvBa通道S3b槳葉結(jié)構(gòu)和S1-S2胞外環(huán)上的氨基酸殘基進(jìn)行丙氨酸掃描突變顯示著兩個(gè)區(qū)域不參與結(jié)合毒素。
　　JZTX-27能夠抑制哺乳動(dòng)物鈉通道Nav1.3-Nav1.5，Nav1.7的峰電流，并延緩?fù)ǖ离娏鞯氖Щ钕?。但毒素不影響DRG TTX-R鈉通道以及Nav1.1通道的電流。JZTX-27延緩Nav1.5通道快失活的半有效劑量為0.7μM。
　　綜上所述，我們應(yīng)用RTX