AcMNPV中類芋螺毒素基因的功能分析.pdf

1、多種桿狀病毒中存在類芋螺毒素(ctx)基因,與海洋生物-芋螺中的ω-芋螺毒素具有類似的半胱氨酸基序(CX3GX2CX5CCX3CX6C)。通過(guò)氨基酸序列的同源性比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)在21種桿狀病毒中存在28個(gè)CTX序列,其中6種桿狀病毒分別包含2個(gè)或2個(gè)以上CTX序列,其開(kāi)放讀碼框的長(zhǎng)度大約為48-68個(gè)氨基酸殘基。Eldridge等對(duì)苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedro

2、sis virus,AcMNPV)中的CTX進(jìn)行了研究,證明了CTX多肽產(chǎn)物的存在,但未發(fā)現(xiàn)其功能。雖然家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori NPV,BmNPV)與AcMNPV同源性很高,但在BmNPV中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ctx基因。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建含ctx基因的重組病毒BmNPVs和AcMNPVs,對(duì)ctx基因進(jìn)行研究。
　　 通過(guò)PCR擴(kuò)增AcMNPV中的ctr基因。利用KnpI和BamHI雙酶切轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacl

3、,插入該基因;另外,利用SnaBI和BamHI切除多角體啟動(dòng)子,置換上iel啟動(dòng)子,構(gòu)建在iel啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)外源基因的重組病毒。本實(shí)驗(yàn)利用BmNPV桿粒系統(tǒng)分別構(gòu)建了多角體啟動(dòng)子和iel啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的重組穿梭載體Bm-pFastBacl-Piel-ctx,Bm-pFastBacl-ph-ctx和Bm-pFastBacl-ph-ctx-eGFP;同時(shí),利用AcMNPV桿粒系統(tǒng)構(gòu)建了重組病毒Ac-pFastBacl-Piel-ctx和A

4、c-pFastBacl-Piel-ctx-eGFP。
　　 為分析ctx基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位,以eGFP為報(bào)告基因,將其連接到ctx的3'端,分別以BmNPV和AcMNPV桿粒作為載體來(lái)表達(dá)融合蛋白CTX-eGFP。在共聚焦掃描顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),熒光信號(hào)主要集中在細(xì)胞膜上,說(shuō)明該蛋白是分泌型的,與其含信號(hào)肽序列的特征相符。
　　 為研究ctr表達(dá)產(chǎn)物的功能,分別用重組病毒Bm-pFastBacl-Piel-ctx,Bm

5、-pFastBacl-ph-ctx和野生型BmNPV感染家蠶細(xì)胞(BmN),Ac-pFastBacl-Piel-ctx和AcMNPV感染Tn細(xì)胞。感染3天后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)病變。收集細(xì)胞液,做蟲體實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型病毒相比,重組病毒BmNPVs具有明顯的抑制家蠶幼蟲和蛹血液黑化的作用。同時(shí),以重組病毒AcMNPVs做抑菌活性分析,結(jié)果表明,Ac-pFastBacl-Piel-ctx對(duì)金黃色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢桿菌等臨床致病菌有