人鼻上皮干細(xì)胞體外模型的構(gòu)建及Ki67在人鼻上皮中表達(dá)及分布的研究.pdf

1、研究背景：
　　慢性鼻-鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis，CRS)與鼻息肉(Nasal polyps，NPs)的發(fā)生密切相關(guān)，大約有20％的CRS患者同時(shí)伴有鼻息肉。大多數(shù)的NPs患者的上皮出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能異常，包括上皮增生和鱗狀上皮化生，黏膜的慢性炎癥和異常上皮組織重塑是其主要的組織學(xué)特征。
　　由于NPs復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和較高的復(fù)發(fā)率，耳鼻喉科醫(yī)師對其診斷和治療面臨著極大的挑戰(zhàn)。相關(guān)研究表明，NPs的發(fā)生

2、發(fā)展過程中上皮改變起到十分重要的作用。然而，由于缺乏鼻上皮干細(xì)胞特性的關(guān)鍵信息，仍然很難區(qū)別鼻腔上皮正常和異常修復(fù)的潛在機(jī)制。有研究表明鼻腔上皮中的基底細(xì)胞具有干/祖細(xì)胞的特性并在上皮修復(fù)方面起到重要作用。因此，通過體外培養(yǎng)及比較來自正常鼻腔黏膜和鼻息肉組織的鼻上皮于細(xì)胞有助于我們從一個(gè)不同的，更特殊的方面闡明鼻腔疾病的病理生理過程。
　　多年來Ki67細(xì)胞核抗體做為評價(jià)細(xì)胞增殖能力的預(yù)測標(biāo)記物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。Ki67在所有活動的

3、細(xì)胞周期都出現(xiàn)表達(dá)（G1期，S期，G2期和M期），但是在靜止期不表達(dá)（G0期）。Ki67表達(dá)的增加與腫瘤的惡性程度有關(guān)，與組織的炎癥程度相關(guān)（例如，哮喘，膽脂瘤）。既往研究顯示，鼻息肉患者重塑上皮中Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量，與正常對照組相比出現(xiàn)明顯增加。
　　到目前為止，大多數(shù)的研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemical，IHC)方法分析Ki67抗體抗人Ki67蛋白(pKi67)的陽性表達(dá)水平。但是，較少的研究關(guān)注K

4、i67蛋白的分布情況（如，結(jié)構(gòu)和位置），而這些方面可能對Ki67蛋白功能的研究更有意義。按照人Ki67蛋白(pKi67)在細(xì)胞周期的不同階段，在培養(yǎng)的MCF7細(xì)胞中可以分成三種亞型:1）離散的顆粒分布在細(xì)胞核漿(早期G1);2)聚集的顆粒局限在核仁（S期到G2期）;3）聚集物分布于染色體周邊(M期）。
　　本研究的目的就是通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探討鼻息肉上皮（增生的上皮和鱗狀化生的上皮）以及正常鼻黏膜上皮中基底細(xì)胞類型以及基底細(xì)胞中K

5、i67蛋白的表達(dá)和分布類型。這些結(jié)果將同時(shí)與細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記物的mRNA水平進(jìn)行比較。希望本研究結(jié)果能夠?yàn)楸窍⑷庵厮苌掀撛诘姆肿訖C(jī)制提供新的見解。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、構(gòu)建人上鼻上皮干/祖細(xì)胞(hNESPCs)體外模型。將來源于鼻息肉黏膜和對照組下鼻甲黏膜經(jīng)過酶消化后得到的分離細(xì)胞(原代細(xì)胞，P0)種植于準(zhǔn)備好的NIH/3T3上，以2×103細(xì)胞數(shù)/cm2的密度接種于24孔板在無血清培養(yǎng)基中生長。我們在hNESPCs細(xì)

6、胞覆蓋達(dá)80％的密度，使用酶消化的方法進(jìn)行傳代。每個(gè)樣本在每一代通過計(jì)算克隆形成率和細(xì)胞倍增時(shí)間，來研究hNESPCs細(xì)胞的生長和增殖能力。hNESPCs細(xì)胞在氣-液界面(Air-liquid interface，ALI)進(jìn)行分化培養(yǎng)，通過免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色(IF)和纖毛擺動頻率(CBF)測定進(jìn)一步分析hNESPCs的分化能力并觀察分化過程。
　　2.Ki67蛋白在hNESPCs體外模型中表達(dá)及分布的研究。原代細(xì)胞種植后48小時(shí)

7、或P1細(xì)胞(P2、P3)傳代72小時(shí)后，福爾馬林固定細(xì)胞用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色，同時(shí)在這個(gè)時(shí)刻收集細(xì)胞的RNA用于進(jìn)一步研究。我們采用倒置相差顯微鏡，每個(gè)樣本選擇三個(gè)視野（×400倍）觀察并計(jì)數(shù)p63+細(xì)胞、Ki67+細(xì)胞以及p63+/Ki67+雙重陽性細(xì)胞，觀察分析Ki67陽性細(xì)胞的三種亞型并拍照。采用RT-PCR方法研究Ki67蛋白及細(xì)胞周期標(biāo)記物mRNA水平在hNESPCs細(xì)胞傳代過程中表達(dá)及分布情況。運(yùn)用Mann-Whitney檢

8、驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3.Ki67蛋白在鼻上皮細(xì)胞中表達(dá)及分布的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。樣本來自55例鼻息肉患者和18例正常對照組（下鼻甲）。其中15例鼻息肉患者經(jīng)過3周糖皮質(zhì)激素治療，并在治療前后分別取其息肉樣本。部分組織固定于福爾馬林溶液中進(jìn)行IHC和IF染色用于組織學(xué)評估。另一部分組織采用RT-PCR方法進(jìn)行mRNA水平檢測。分類變量的組間不同的比較采用Fisher精確檢驗(yàn)。運(yùn)用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析鼻息肉組和正常對照

9、組之間Ki67、p63陽性細(xì)胞數(shù)目、Ki67亞型的百分比、Ki67以及細(xì)胞周期標(biāo)記物mRNA水平的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.我們的研究證實(shí)可以從人鼻黏膜組織中分離和培養(yǎng)hNESPCs，并在至少前四代中能維持他們自我更新和分化的潛能。hNESPCs細(xì)胞可以成功的在氣液界面上(ALI)分化成分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞，與呼吸道的假復(fù)層上皮非常相似。鼠纖維細(xì)胞NIH/3T3可以用作hNESPCs在無血清培養(yǎng)條件下的飼養(yǎng)層。這有助

10、于建立體外篩查和驗(yàn)證人鼻腔上皮細(xì)胞活性及其對治療反應(yīng)的體外模型。
　　2.Ki67蛋白在hNESPCs體外模型中表達(dá)及分布的研究。在鼻息肉和下鼻甲黏膜來源hNESPCs細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Ki67蛋白三種亞型。下鼻甲來源的hNESPCs在體外傳三代(P1，P2，P3)的過程中，Ⅰ型Ki67細(xì)胞占總體Ki67陽性細(xì)胞百分比分別為(18.0％，18.4％，18.6％)，Ⅱ型Ki67細(xì)胞百分比分別為(82.0％，81.6％，81.4％)。然而，

11、Ⅰ型Ki67細(xì)胞百分比在鼻息肉來源hNESPCs細(xì)胞傳代過程中逐漸從20.0％，29.58％上升到40.0％而且Ⅱ型Ki67細(xì)胞百分比在細(xì)胞傳代過程中逐漸從80.0％，70.14％下降到60.0％。此外，在P3代細(xì)胞中，Ⅰ型Ki67細(xì)胞百分比（p=0.04）與Ⅱ型Ki67細(xì)胞百分比(p=0.04)在鼻息肉來源的hNESPCs與正常鼻黏膜來源的hNESPCs之間的差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅲ型Ki67細(xì)胞在鼻息肉和正常鼻黏膜來源的hNESPCs

12、體外傳代過程(P1-P3)中幾乎沒有觀察到。G1期相關(guān)的細(xì)胞周期標(biāo)記物（CCND1、CDK4和CDK6）以及促進(jìn)S期進(jìn)入有絲分裂期（M期）的細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記物（CCNE1、CDK2、CCNA2和CDK1）在鼻息肉患者中表達(dá)量與對照組相比出現(xiàn)了顯著下降。M期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（CDK1、CCNA2和CCNB1）的mRNA表達(dá)水平在鼻息肉上皮的傳代過程中與正常組相比差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.Ki67蛋白在鼻上皮細(xì)胞中表達(dá)及分布的體

13、內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。與對照組相比，p63陽性細(xì)胞數(shù)目在鼻息肉增生上皮（1.53倍，p＜0.0001）和鱗狀上皮化生上皮（2.02倍，p＜0.0001）明顯增加。增生的基底細(xì)胞有三種類型(p63+/Ki67+)并出現(xiàn)在細(xì)胞周期的不同階段，例如G1期（Ⅰ型細(xì)胞），S期到G2期（Ⅱ型細(xì)胞）以及有絲分裂期(Ⅲ型細(xì)胞)。最重要意義的是，一些Ⅰ型細(xì)胞增殖后可能會進(jìn)入靜止期，雖然這些細(xì)胞仍然是p63+/Ki67+陽性細(xì)胞。Ⅰ型細(xì)胞與Ⅱ型細(xì)胞在正常鼻上皮中的比

14、值是50∶50。然而，鼻息肉增生上皮和鱗狀上皮化生上皮中，Ⅰ型細(xì)胞的百分比與對照組相比，分別上升到63.03％和64.26％，Ⅱ型細(xì)胞的百分比分別降低到34.85％和30.77％，另外Ⅲ型細(xì)胞在鼻息肉鱗狀化生的上皮中百分比是3.45％。
　　G1期相關(guān)的細(xì)胞周期標(biāo)記物（CCND1、CDK4和CDK6）和促進(jìn)S期進(jìn)入有絲分裂期（M期）的細(xì)胞周期相關(guān)標(biāo)記物（CCNE1、CDK2、CCNA2和CDK1）在鼻息肉患者中的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正

15、常對照組的表達(dá)量。M期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（CDK1、CCNA2和CCNB1）在鼻息肉鱗狀化生上皮的mRNA表達(dá)水平要明顯超過鼻息肉增生上皮的表達(dá)量。IF結(jié)果顯示鼻息肉患者經(jīng)過GC治療后Ki67陽性細(xì)胞數(shù)目6.0(4.0-8.0)與治療前的數(shù)目13.0(8.0-16.0)相比出現(xiàn)了明顯下降(p＜0.05)。然而，鼻息肉患者的Ⅰ型Ki67細(xì)胞百分比和Ⅱ型Ki67細(xì)胞百分比之間的不平衡在經(jīng)過3周GC治療后并沒有改善。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：