新型隱球菌FQ-PCR檢測體系在血流感染動物模型的應用研究.pdf

1、目的：建立新型隱球菌血流感染動物模型，收集動物血漿和肺泡灌洗液標本，同時進行FQ-PCR、培養(yǎng)、墨汁染色、組織病理、乳膠凝集實驗對照觀察，探討FQ-PCR檢測體系在動物模型標本中DNA的診斷價值及與所選的四種比較方法的優(yōu)選性，奠定臨床真菌 PCR檢測試劑盒開發(fā)的基礎，以實現(xiàn)真菌感染的早期臨床診治，降低臨床真菌感染的病死率及治療成本。
　　方法：
　　1、實驗研究方案：（1）標準株培養(yǎng)及制備，標準新型隱球菌接種于PDA平板37

2、℃培養(yǎng)48小時后，用接種環(huán)刮取菌落溶于生理鹽水放入已消毒的EP管中；通過血細胞計數(shù)板計數(shù)，制成細胞濃度約為106CFU/ml的混懸液，作為標準株儲存液，置于-80℃冰箱備用。（2）動物模型，32只雄性SD大鼠，采用隨機分配原則分為4組，同時稱重，編號，分別籠養(yǎng)，按時提供食物和水。A組：免疫抑制感染組（n=10只）:注射環(huán)磷酰胺（150mg/kg）溶液進行免疫抑制大鼠，尾靜脈注射新型隱球菌菌懸液感染動物；B組:正常狀態(tài)感染組（n=10）,

3、注射等量的生理鹽水，模型建立后尾靜脈注射新型隱球菌菌懸液感染動物 C組:正常對照組（n=6）:正常飼養(yǎng)；D組免疫抑制對照組（n=6）；僅注射環(huán)磷酰胺（150mg/kg）溶液進行免疫抑制大鼠。A+B為實驗組（感染后第3天全部處死），C+D為對照組（感染后第3天全部處死）。
　　2、統(tǒng)計學方法：全文在數(shù)據(jù)處理和分析中均采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，將采集的實驗組和對照組動物的血清和支氣管肺泡灌洗液標本FQ-PCR檢測后結

4、果進行比較。實驗組不同天數(shù)與對照組先進行總體的χ2檢驗，當 P<0.05，實驗組與對照組差異有統(tǒng)計學意義。各實驗組不同時間點與同一對照組進行兩兩比較，檢驗水準要調整為a--0.05/2(5.1)，即當P<0.00625時，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、免疫抑制感染組感染后24小時出現(xiàn)開始出現(xiàn)食欲差，活動減少，被毛失去光澤，鼠毛蓬亂，前足抱頭身體呈弓形逐；正常狀態(tài)感染組僅見3例食欲減低，活動少，對照組一般情況良好；<

5、br>　　2、感染后第3天處死大鼠，取肺組織和其它臟器（肝、脾、腦）。實驗組與正常對照組大鼠比較，肺組織密布隆起灰白色結節(jié)，脾稍大，其他臟器未見異常；
　　3、將正常鼠的血漿101CFU/ml混懸液進行1:1、1:2、1:3、1:4稀釋，熱帶念珠菌標準株102CFU/ml混懸液進行1:1、1:2、1:3、1:4稀釋，提取DNA后進行PCR擴增，重復8次。新型隱球菌標準株混懸液經1:1稀釋后能完全擴增，而經1:2、1:3、1:4稀釋

6、后樣本未見擴增或僅部分擴增，該四種反應體系能檢測的靈敏度均可以達到105CFU/ml；
　　4、將收集的血清及肺組織提取DNA進行FQ-PCR檢測，實驗組陽性率較正常對照組和免疫對照組高，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義，隨感染時問延長，陽性率逐漸上升，感染后8小時之前實驗組FQ-PCR結果與免疫抑制和正常對照組差異均無顯差異；
　　5、在FQ-PCR與血培養(yǎng)、莢膜抗原檢測、墨汁染色四種對新型隱球菌檢測的敏感性比較中，F(xiàn)Q-P

7、CR驗敏感性最高，其敏感性為100％,而莢膜抗原達96.2%，血培養(yǎng)敏感性最低，為58.8%，F(xiàn)Q-PCR技術在診斷新型隱球菌的敏感性方面明顯高于血培養(yǎng)、墨汁染色、莢膜抗原實驗（χ2＝8.694，P＝0.031）；FQ-PCR技術在診斷新型隱球菌的特異性方面明顯高于血培養(yǎng)、墨汁染色、莢膜抗原實驗（χ2＝12.129，P＝0.021）；
　　6、101拷貝數(shù)/ul是FQ-PCR的最低檢測出來的濃度，上述結果表明：通過采用實時熒光的方

8、法利用定量PCR的對FQ-PCR靈敏度進行檢測，其靈敏度為101拷貝數(shù)/ul；
　　7、在六種菌株中，只有新型隱球菌表現(xiàn)出明顯的特異性擴增，剩余的五種菌株均沒有發(fā)現(xiàn)有熒光曲線增長的現(xiàn)象，上述結果進一步說明FQ-PCR檢測方法對新型隱球菌的檢測具有較好的特異性；
　　8、分別將 FQ-PCR檢測所應用的質粒標準品中的109拷貝數(shù)/ul、107拷貝數(shù)/ul、105拷貝數(shù)/ul三個濃度定義為高、中、低，通過批內重復性檢驗，可見上述