建立實(shí)時熒光定量PCR檢測新型隱球菌CAP10基因及臨床初步應(yīng)用.pdf

1、目的： 建立實(shí)時熒光定量PCR(real-timeFluorescentQuantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR)系統(tǒng)，定量檢測新型隱球菌(Cryptococcusneoformans，CN)莢膜相關(guān)蛋白10(Capsuleassociatedprotein，CAP10)基因mRNA表達(dá)量及其變化，為將其應(yīng)用于新型隱球菌感染的診斷和療效判斷奠定基礎(chǔ)。 方法： 根據(jù)新型隱球菌5種血清型(A、B、C、D、AD)中

2、同源序列設(shè)計(jì)引物和探針，PCR擴(kuò)增CAP10基因片段，并將其克隆到pGEM-TEasy載體上，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；建立FQ-PCR體系，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)；檢測23例新型隱球菌性腦膜炎患者抗真菌藥物治療前后腦脊液(CSF)中隱球菌的CAP10mRNA含量并結(jié)合臨床和其他實(shí)驗(yàn)室資料進(jìn)行分析。用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1.FQ-PCR系統(tǒng)用于檢測CAP10基

3、因片段，靈敏度為101拷貝數(shù)/μ1:批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為0.31％，批間CV為2.72％，重復(fù)性好；對臨床其他常見腦膜炎病原體不出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，特異性好。 2.好轉(zhuǎn)組CAP10mRNA拷貝數(shù)治療前、后CAP10mRNA拷貝數(shù)(log10值)分別為1.28、0.75(n=20，P<0.05)，有顯著性差異。CAP10mRNA拷貝數(shù)與隱球菌總量呈正相關(guān)(r=0.446，P<0.05)，與顱內(nèi)壓呈正相關(guān)(r=0.671，P<0.

4、05)，與白細(xì)胞計(jì)數(shù)無關(guān)(r=0.173，P>0.05)。兩性霉素與5-氟胞嘧啶聯(lián)用組治療前、后CAP10mRNA拷貝數(shù)(log10值)分別為3.43、2.35(n=11，P<0.05)，有顯著差異：大扶康與5-氟胞嘧啶聯(lián)用組治療前、后CAP10mRNA拷貝數(shù)(log10值)分別為2.65、1.84(n=12，P<0.05)，有顯著差異；兩藥物組治療后CAP10mRNA拷貝數(shù)的下降量分別為1.07、1.06，P>0.05，無顯著差異。