采用LAMP法和FQ-PCR法檢測(cè)痰液標(biāo)本中的肺炎鏈球菌.pdf

1、目的： 1.了解LAMP(環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增)方法的技術(shù)原理，操作步驟。對(duì)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法的各組分進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，找到該方法的最佳組分濃度和反應(yīng)溫度。 2.通過(guò)比較LAMP法，PCR法及傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)臨床痰液標(biāo)本中肺炎鏈球菌檢測(cè)的結(jié)果，了解LAMP法的特點(diǎn)。評(píng)估LAMP方法應(yīng)用于臨床診斷，并成為一種臨床快速檢測(cè)痰液標(biāo)本中肺炎鏈球菌的新方法的可能性。 3.采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)痰液中的肺炎鏈球菌。獲得該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲

2、線，得到痰液中肺炎鏈球菌DNA的濃度，建立一種快速檢測(cè)痰液標(biāo)本中肺炎鏈球菌的方法。 4.采用熒光定量PCR技術(shù)獲得痰液標(biāo)本中的肺炎鏈球菌的拷貝濃度，評(píng)估病人痰液中的肺炎鏈球菌DNA濃度與該菌是否為導(dǎo)致疾病的致病菌之間的可能關(guān)系，并以此來(lái)為臨床是否對(duì)細(xì)菌室報(bào)送的肺炎鏈球菌陽(yáng)性結(jié)果采取措施提供指導(dǎo)。 方法： 1.改變各種LAMP檢測(cè)的相關(guān)試劑成分和反應(yīng)溫度，摸索最佳的濃度和比例以及反應(yīng)溫度。 2.采用LAMP

3、法對(duì)多種標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。 3.將肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株制得的總DNA進(jìn)行系列梯度稀釋?zhuān)謩e采用LAMP法和PCR法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度。 4.采用LAMP法和PCR法對(duì)經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)方法檢測(cè)出肺炎鏈球菌的痰液和未檢出肺炎鏈球菌的痰液標(biāo)本各41例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。觀察LAMP方法檢測(cè)臨床痰液標(biāo)本中的肺炎鏈球菌的效果。 5.對(duì)已知濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)褂脽晒舛縋CR商品試劑盒分別對(duì)其進(jìn)

4、行擴(kuò)增，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)標(biāo)本中的肺炎鏈球菌DNA濃度。 6.將痰液標(biāo)本中的肺炎鏈球菌拷貝濃度與被檢測(cè)病人臨床診斷內(nèi)容相結(jié)合，制作ROC曲線，判斷肺炎鏈球菌的DNA濃度與病人標(biāo)本中的肺炎鏈球菌的來(lái)源的可能關(guān)系。 結(jié)果： 1.通過(guò)對(duì)LAMP體系中的各組分進(jìn)行優(yōu)化，找到該反應(yīng)針對(duì)肺炎鏈球菌檢測(cè)的最佳各組分濃度和反應(yīng)溫度。包括1.6μmol/L的引物FIP和BIP，0.2μmol/L的引物F3和B3，8U Bst DN

5、A聚合酶(附帶含2 mM MgSO4的緩沖液)，1.0mM(each) dNTP，20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)2SO4，6mmol/L MgSO4，0.1％ Triton X-100，0.8mol/L Betaine和5μl已制得的模板液，最后補(bǔ)雙蒸水至50μl。反應(yīng)條件為63℃60min進(jìn)行擴(kuò)增，80℃2min滅活酶的活性。 2.通過(guò)對(duì)9種非肺炎鏈球菌和2種肺炎鏈球菌

6、的LAMP檢測(cè)表明，非肺炎鏈球菌菌株不能通過(guò)該方法被檢出，而肺炎鏈球菌則能夠被檢出。 3.對(duì)由標(biāo)準(zhǔn)菌株制得的已知濃度的細(xì)菌總DNA模板液進(jìn)行梯度稀釋后，進(jìn)行LAMP法和PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LAMP法在35min和60min時(shí)檢測(cè)lytA基因的最低菌液濃度分別為103cfu/ml和102cfu/ml，而PCR法在30個(gè)循環(huán)的時(shí)間里檢測(cè)lytA基因的最低菌液濃度為104cfu/ml。LAMP法(60min)比PCR法(30個(gè)循環(huán))敏感

7、性高二個(gè)數(shù)量級(jí)。 4.本研究共檢測(cè)了82例痰液標(biāo)本，其中41例用傳統(tǒng)檢測(cè)方法檢出肺炎鏈球菌的標(biāo)本用LAMP法和PCR方法也都能夠檢出。另外41例用傳統(tǒng)檢測(cè)方法沒(méi)有檢測(cè)到肺炎鏈球菌的標(biāo)本中PCR法檢測(cè)到了6例陽(yáng)性，LAMP法檢測(cè)到了13例陽(yáng)性，x2=4.2312，P>0.1，三種檢測(cè)方法沒(méi)有顯著差別。 5.對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和濃度檢測(cè)，將已知濃度的產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋后分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到了一條PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8、 6.通過(guò)對(duì)病人的臨床診斷和熒光定量PCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在痰液肺炎鏈球菌拷貝濃度為103-109/ml之間時(shí)，病人呼吸道疾病的病情存在較大的輕重差異。通過(guò)對(duì)結(jié)果的ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，最佳的截?cái)嘀凳?.95×105/ml，在此時(shí)其靈敏度是85.7％，特異性是76.9％。 結(jié)論： 1.環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)肺炎鏈球菌的方法具有可行性，而且該方法的特異性和靈敏度均較好，在痰液標(biāo)本制得的總DNA溶液復(fù)雜成分條件下也

9、能夠取得成功。 2.我們將LAMP法、PCR法及傳統(tǒng)方法對(duì)82例痰液標(biāo)本中肺炎鏈球菌的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，三種方法沒(méi)有顯著性差別。但是LAMP方法具有的檢測(cè)快速，成本低等優(yōu)點(diǎn)較其它兩種方法仍有很大的優(yōu)勢(shì)。可以對(duì)此種方法進(jìn)一步研究完善，以滿足真正用于臨床應(yīng)用的要求。 3.采用熒光定量PCR對(duì)痰液標(biāo)本進(jìn)行肺炎鏈球菌定量檢測(cè)的嘗試被證明是可行的。在對(duì)PCR體系和溫度進(jìn)行充分優(yōu)化，并對(duì)引物的特異性進(jìn)行充分驗(yàn)證的情況下，該方法