精原干細(xì)胞體外基因轉(zhuǎn)染及其移植的初步研究.pdf

1、揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文精原干細(xì)胞體外基因轉(zhuǎn)染及其移植的初步研究姓名：陳芳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：動(dòng)物學(xué)指導(dǎo)教師：邢華李厚達(dá)20090601揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文II結(jié)果：QSSCs的分離、純化和培養(yǎng)：78日齡是用于小鼠SSCs分離的最佳年齡段，4—45月齡是用于犬SSCs分離研究的最佳年齡段；采用029／L膠原酶025％胰蛋白酶復(fù)合酶消化法消化生精上皮，小鼠和犬SSCs活率分別達(dá)至1J9773％和9581％；所獲得的SSCs經(jīng)差速貼壁法純化

2、后純化率為6078％(小鼠)和5086％(犬)；將純化后的SSCs培養(yǎng)于支持細(xì)胞飼養(yǎng)層上，SSCs貼壁時(shí)間為培養(yǎng)8h12h，SSCs呈扁平圓形或卵圓形，大小均一，單個(gè)散在或多個(gè)成團(tuán)、鏈狀存在。②SSCs的體外基因轉(zhuǎn)染：磷酸鈣法、陽(yáng)離子聚合物法(含血清體系)和陽(yáng)離子聚合物法(無血清體系)均可將外源EGFP基因?qū)隨SCs中，并能表達(dá)綠色熒光蛋白。磷酸鈣法對(duì)小鼠和犬SSCs的轉(zhuǎn)染率分別為812％和796％；陽(yáng)離子聚合物法(含血清體系)對(duì)小鼠

3、和犬SSCs的轉(zhuǎn)染率分別為2214％和2369％；陽(yáng)離子聚合物法(無血清體系)對(duì)小鼠和犬SSCs的轉(zhuǎn)染率分別為2158％和2401％。③白消安對(duì)內(nèi)源性SSCs的消除：根據(jù)動(dòng)物的健康存活狀態(tài)及睪丸組織學(xué)結(jié)構(gòu)變化等，確定40mg／kg的注射劑量是消除小鼠內(nèi)源性SSCs的有效劑量；12mg／kg的注射劑量是消除犬內(nèi)源性生精細(xì)胞的有效劑量：④轉(zhuǎn)EGFP基因SSCs的移植結(jié)果：小鼠于移植后1w、2w和3w的睪丸冰凍切片上觀察到熒光，受體睪丸基因組

4、DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增出]“620bp的特異性條帶；犬于移植后在冰凍切片上未見熒光，受體睪丸基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，未觀察到特異性條帶。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功有效地分離培養(yǎng)了小鼠和犬的精原干細(xì)胞，在體外成功地將外源EGFP基因轉(zhuǎn)染Nd鼠和犬的SSCsl為，并將轉(zhuǎn)基因SSCs移植到無精子癥動(dòng)物模型的睪丸內(nèi)，在移植后1w、2w和3w的小鼠睪丸冰凍切片上可見熒光，提示有EGFP基因的表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)為為利用轉(zhuǎn)基因SSCs移植法制備轉(zhuǎn)基因犬奠定