豬Stra8基因的克隆、表達和體外轉(zhuǎn)染精原干細胞的初步研究.pdf

1、精子發(fā)生的場所在雄性動物睪丸的曲細精管內(nèi)，精子由原始精原干細胞經(jīng)過復(fù)雜的精子發(fā)生過程而最終形成。這個過程主要包括三個階段，首先是精原干細胞經(jīng)過有絲分裂大量增殖成為初級精母細胞。其次，初級精母細胞啟動減數(shù)分裂形成圓形的精子細胞。最后，精子細胞通過復(fù)雜的變態(tài)過程形成完整形態(tài)的精子。其中減數(shù)分裂是生殖細胞特有的方式，是精子發(fā)生過程的重要環(huán)節(jié)。生殖細胞減數(shù)分裂的啟動與視黃酸(retinoicacid，RA)和其誘導(dǎo)的Stra8(stimulat

2、edbyretinoicacidgene8)基因的表達密切相關(guān)。視黃酸(retinoicacid，RA)是維生素A在體內(nèi)代謝后的主要活性物質(zhì)。雄性胚胎睪丸的RA活性較低，無Stra8基因的表達使得雄性生殖細胞停留在有絲分裂階段。外源的RA能夠促進體外培養(yǎng)的雄性生殖細胞表達Stra8基因啟動減數(shù)分裂。雄性動物出生后，Stra8基因的表達啟動雄性生殖細胞開始減數(shù)分裂，從而進入精子發(fā)生的階段。公豬睪丸精原細胞減數(shù)分裂的啟動即意味著首次生精波的

3、啟動。不同豬種的精子生成時間有較大的差異。因此減數(shù)分裂啟動時間的早晚對于種公豬的飼養(yǎng)具有重要的經(jīng)濟意義。為了研究Stra8基因在減數(shù)分裂啟動的功能，本試驗對豬Stra8基因cDNA序列進行克隆，并以梅山豬作為試驗動物，研究其在豬的各個組織的表達情況，并構(gòu)建基于EGFP的表達載體，研究其在精原干細胞體外培養(yǎng)過程中的功能，結(jié)果如下:
　　 1.Stra8基因cDNA全序列克隆。通過克隆Stra8基因的部分序列，用于設(shè)計5'RACE和

4、3'RACE的特異性引物，采用PCR方法克隆出Stra8基因的cDNA全序列，將該序列遞交Genbank，序列號為JQ965783，將全長為1444bp的全序列遞交NCBI的ORFFinder，發(fā)現(xiàn)該序列包含147bp的5’端，1101bp的CDS和196bp的3'端，有完整的PolyA尾，但未發(fā)現(xiàn)加尾信號AATAAA。編碼區(qū)編碼367個氨基酸，Stra8編碼氨基酸一級結(jié)構(gòu)表明該蛋白質(zhì)的相對分子量約為41.04kDa，理論等電點約為4.

5、59。進一步對Stra8基因所編碼的氨基酸進行相關(guān)生物信息學(xué)預(yù)測，通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)在所編碼氨基酸序列第3、4和301氨基酸殘基處存在3個O-糖基化位點，第9和116位氨基酸處存在2個N-糖基化位點，并且發(fā)現(xiàn)13個絲氨酸、6個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點。在NCBI的BlastP搜索與豬Stra8基因編碼氨基酸同源的序列，分析Stra8基因編碼氨基酸與其他動物Stra8基因CDS閱讀框的同源性，豬與小鼠的同源性最高達78.4％，與雞的同源性最

6、低，僅為45.4％。
　　 2.梅山豬Stra8基因時空表達譜的構(gòu)建。在mRNA水平上，構(gòu)建Stra8基因的組織表達譜，Stra8基因是一個組織特異性表達的基因，只在公豬的睪丸中表達，而在腦、下丘腦、垂體、心、肝、脾、肺、腎和卵巢等組織中均無表達。對不同時間段梅山豬睪丸組織Stra8基因的表達量進行熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示Stra8基因的表達量隨著梅山豬日齡的變化呈現(xiàn)出上升的趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析Stra8基因在初生、30、60

7、、90及150日齡梅山豬睪丸中睪丸的表達量分別為0.05、0.16、0.5、0.6和1，并且存在著一定的差異，且在150d表達量達到最高。
　　 3.Stra8基因真核表達載體的構(gòu)建和亞細胞定位。采用RT-PCR方法，以成年梅山豬睪丸總RNA為模板擴增Stra8基因的全長cDNA編碼區(qū)序列，采用TA克隆技術(shù)，將目的片段插入到pMD19-T載體中，重組的質(zhì)粒命名為pMD19-T-Stra8，測序鑒定后，再將其CDS序列插入真核表達

8、載體pEGFP-N1中，重組質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-Stra8，將其轉(zhuǎn)化到體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細胞中進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)Stra8蛋白分布在細胞質(zhì)內(nèi)，細胞核內(nèi)無熒光，說明Stra8蛋白屬于細胞質(zhì)表達的蛋白。
　　 4.Stra8轉(zhuǎn)染豬精原干細胞表達的初步研究。通過體外培養(yǎng)豬精原干細胞，將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Stra8轉(zhuǎn)染豬第三代的精原干細胞，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與重組載體轉(zhuǎn)染NIH-3T3的結(jié)果不同的是，該基因所編