HPV16E6基因過表達載體構建及對Me180細胞侵襲與遷移的影響.pdf

1、目的:構建 HPV16E6過表達腺病毒載體,比較 HPV16E6過表達組和空白載體組兩組與空白對照組 Me180細胞侵襲與遷移能力的大小，以及E-cadherin mRNA、蛋白的表達及其啟動子甲基化的狀態(tài)，探究HPV16E6對宮頸癌Me180細胞侵襲與遷移能力的影響及其機制。
　　方法:1.構建HPV16E6腺病毒：將HPV16E6基因亞克隆至腺病毒穿梭質粒pHBAd-MCMV-GFP，用EcoR I和BamH I雙酶切判定、運

2、用PCR技術擴增并將其產物與 pHBAd-MCMV-GFP結合并轉化大腸桿菌,檢測序列是否正確,然后取 HPV16E6過表達腺病毒載體質粒及骨架質粒，用LipofiterTM轉染試劑介導將重組體腺病毒在293A細胞中的包裝擴增純化；2.病毒轉染效果驗證：將過表達 HPV16E6腺病毒轉染的宮頸癌Me180細胞，空白腺病毒轉染的宮頸癌Me180細胞，以及未進行腺病毒轉染的宮頸癌Me180細胞分成3組：HPV16E6過表達組、空白載體組以及

3、空白對照組，用過表達HPV16E6基因的腺病毒及其空白腺病毒載體感染Me180細胞，36小時后觀察綠色熒光表達情況，觀察熒光效果并運用 Western-Blot實驗檢測3組細胞中HPV16E6的表達來驗證其轉染效果；3.細胞遷移與侵襲能力：運用Traswell遷移與侵襲實驗檢測過表達HPV16E6基因對宮頸癌Me180細胞系遷移與侵襲能力的影響；4.機制研究：運用 RT-qPCR實驗及Western-Blot實驗檢測3組細胞中E-cad

4、herin mRNA及其蛋白的表達，分析HPV16E6基因對Me180細胞遷移與侵襲能力影響的機制，并進一步運用甲基化特異性 PCR檢測三組細胞 E-cadherin甲基化狀態(tài)進行驗證。
　　結果：1.通過瓊脂糖凝膠電泳試驗、測序結果證實了攜帶 HPV16E6序列穿梭載體構建成功,熒光顯微鏡圖片及Western blot結果顯示過表達HPV16E6的腺病毒已成功轉染至宮頸癌Me180細胞中，轉染效率高（80％-90%）；2.Tra

5、nswell遷移與侵襲實驗中，過表達 HPV16E6腺病毒轉染宮頸癌 Me180細胞后，同空白對照組相比較其細胞的遷移與侵襲能力顯著增強（P＜0.05），而空白載體組相對空白對照組，其細胞的侵襲與遷移能力無明顯改變(P＞0.05)；3. RT-qPCR及Western-Blot實驗中，過表達 HPV16E6組同空白對照組相比較，其E-cadherin mRNA及其蛋白的表達呈顯著下降（P＜0.05）,而空白載體組的與空白對照組相比較，其

6、E-cadherin mRNA及其蛋白表達水平無明顯變化(P＞0.05)；4.甲基化特異性PCR顯示，過表達HPV16E6組的細胞E-cadherin啟動子區(qū)呈完全甲基化狀態(tài)，其甲基化程度明顯高于空白對照組（P＜0.05）,而空白載體組甲基化程度與空白對照組相比較，無明顯差異性（P＞0.05）。
　　結論：1.HPV16E6基因可能通過下調宮頸癌細胞系 Me180中E-cadherin的表達水平增強宮頸癌細胞系Me180細胞遷移與