HPV16E6對不同p53基因型宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響.pdf

1、目的：探討HPV16E6對不同p53基因型的宮頸癌細(xì)胞生長增殖、凋亡及化療藥物敏感性的影響。 方法： 第一部分：通過脂質(zhì)體法將HPV16E6基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌C33A細(xì)胞，RT-PCR及Western blotting分別檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HPV16E6mRNA和蛋白表達水平，MTT比色法及流式細(xì)胞儀檢測HPV16E6基因轉(zhuǎn)染對C33A細(xì)胞生長增殖與細(xì)胞周期的影響。 第二部分：應(yīng)用MTT比色法檢測DDP、BLM、VC

2、R、DDP+BLM+VCR對宮頸癌細(xì)胞生長增殖的影響；AO/EB染色結(jié)合熒光顯微鏡技術(shù)及Annexine V-FITC/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測不同濃度DDP干預(yù)前后宮頸癌細(xì)胞凋亡情況；Western blotting檢測不同濃度化療藥物DDP干預(yù)后對HPV16E6和p53<'mt>蛋白表達的影響；RT-PCR檢測不同濃度DDP干預(yù)對各組宮頸癌細(xì)胞HPV16E6基因mRNA表達水平的影響。 結(jié)果： 第一部分：通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

3、獲得了穩(wěn)定表達pcDNA3-HPV16E6質(zhì)粒的C33A細(xì)胞克隆(C33A-E6細(xì)胞)及穩(wěn)定復(fù)制空載體質(zhì)粒的細(xì)胞克隆(C33A-P細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染HPV16E6基因的C33A細(xì)胞的生長速度比空白對照組和C33A組明顯加快(P<0.05)。HPV16E6對C33A細(xì)胞生長增殖有促進作用。在轉(zhuǎn)染了HPV16E6基因的C33A細(xì)胞中，其DNA合成前期G1和靜止期G0(G<,0>/G<,1>期)細(xì)胞百分率(39.27％)明顯低于空載體轉(zhuǎn)染組(53.

4、73％)和未處理的C33A細(xì)胞(55.38％)；而處于S期細(xì)胞的百分率(38.83％)、DNA合成后期G2及分裂期M的細(xì)胞百分率(G2/M：21.9％)，均明顯高于空載體轉(zhuǎn)染組(S：29.36％；G2/M：16.91％)和C33A組(S：28.04％；G2/M：16.58％)?？蛰d體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期的各期分布無明顯差異。 第二部分：MTT結(jié)果顯示，在相同作用時間，四組細(xì)胞均隨著化療藥物濃度增大，細(xì)胞存活率逐漸下降，以10

5、倍、5倍血藥峰值濃度干預(yù)的各組細(xì)胞生長抑制最明顯。10％、50％PPC及DMSO干預(yù)組細(xì)胞存活率均無顯著性差異。200％、100％PPC干預(yù)組存活率明顯低于10％與DMSO組。聯(lián)合用藥的細(xì)胞存活率顯著低于單藥干預(yù)組，而在DDP、BLM、VCR單藥干預(yù)的各組細(xì)胞中，較多數(shù)據(jù)顯示DDP干預(yù)組細(xì)胞的存活率明顯低于BLM和DVCR干預(yù)組，而BLM和HVCR干預(yù)組之間無顯著差異。在相同作用時間和相同劑量藥物干預(yù)時，C33A-E6組細(xì)胞的存活率略高

6、于C33A和C33A-P組，但僅少部分有統(tǒng)計學(xué)差異；C33A-E6與CaSki細(xì)胞比較存活率亦無統(tǒng)計學(xué)差異， AO/EB染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測的C33A、C33A-E6、C33A-P、CaSki細(xì)胞隨著DDP干預(yù)濃度的改變而凋亡率亦不同，80umol/L、8umol/L及0.8umol/L的DDP干預(yù)后各株細(xì)胞凋亡率均有顯著性差異，隨著DDP劑量的增大，凋亡率亦明顯增加。對于不同時間段比較，大劑量DDP即80umol/L干預(yù)組與DMSO干

7、預(yù)組中各株細(xì)胞的24hr、48hr及72hr的凋亡率無明顯改變；小劑量即0.8umol/L組凋亡率在干預(yù)48hr后至72hr凋亡率明顯增加；中劑量即8umol/L組凋亡率在干預(yù)48hr即顯著增加，但持續(xù)至72hr時后未明顯增高；0.8umol/L組與DMSO組凋亡率無顯著性差異。 Western Blotting驗證結(jié)果顯示：C33A-E6和CaSki細(xì)胞中均能檢測到HPV16E6蛋白的表達，但表達較弱，且隨著化療藥干預(yù)劑量的增

8、大及作用時間的延長，兩組細(xì)胞總蛋白中HPV16E6的表達量均逐漸降低甚至難以檢測到表達，而未干預(yù)的對照組C33A-E6和CaSki細(xì)胞中HPV16E6的表達量稍有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義：C33A和C33A-P細(xì)胞中均未檢測到HPV16E6蛋白的表達。C33A-E6、C33A和C33A-P三組細(xì)胞中均檢測到p53<'mt>的表達，但隨著DDP干預(yù)劑量的增大及作用時間的延長，三組細(xì)胞總蛋白中p53<'mt>的表達量均無明顯改變。

9、通過RT-PCR檢測不同濃度DDP干預(yù)C33A、C33A-E6、C33A-P和CaSki四組細(xì)胞24hr、48hr后HPV16E6基因mRNA表達的變化，在未予DDP干預(yù)的情況下，C33A-E6與CaSki細(xì)胞在24hr時HPV16E6 mRNA的表達量無差異，而在48hr時則C33A-E6細(xì)胞的HPV16E6 mRNA表達量顯著高于CaSki細(xì)胞，且兩組細(xì)胞48hr的HPV16E6 mRNA表達均較24hr顯著增高；在24hr和48h

10、r兩時間段內(nèi)，隨著DDP干預(yù)濃度的增加，兩組細(xì)胞的HPV16E6 mRNA表達量均逐漸減少；但在同樣濃度的DDP干預(yù)時，C33A-E6與CaSki的HPV16E6 mRNA表達量無顯著性差異。 結(jié)論：HPV16E6基因具有促進宮頸癌細(xì)胞生長增殖及凋亡的雙重作用，p53<'mt>對C33A細(xì)胞的生長增殖及對化療藥物的敏感性無明顯影響，HPV16E6基因與p53<'mt>對宮頸癌C33A細(xì)胞無協(xié)同促進增殖和凋亡的作用。HPVE6基因