HPV16E6與Daxx相互作用的效果及機制.pdf

1、目的：研究人乳頭瘤病毒16型(HPV16) E6蛋白與Daxx相互作用對其DNA啟動子序列的轉錄調控作用，分析 Daxx對E6 DNA復制的影響，為進一步探討 Daxx在HPV16 E6致癌機制中的作用提供實驗參考依據(jù)。
　　方法：
　　(1)培養(yǎng)Caski細胞，經甲醛交聯(lián)固定，超聲破碎細胞，離心收集上清液，將上清液分4組：A組（實驗組）加入兔抗HPV16 E6 IgG，B組（陽性對照組）加入Anti-RNA polymer

2、aseⅡ抗體，C組為 Input，D組（陰性對照組）加入小鼠 IgG?？贵w孵育過夜后加入Protein G Agarose沉淀抗原抗體復合物，并用洗脫液清洗，收集上清液，65℃過夜解交聯(lián)后回收DNA樣品， PCR分析Daxx基因片段。
　　(2)用Prime5.0軟件分別設計Daxx基因啟動子序列片段 Daxx-1~-695nt、Daxx-1~-161nt與Daxx-161~-695nt引物，引入NcoI/HindⅢ酶切位點，以D

3、axx基因組為模板PCR擴增目的基因，分別用NcoI/HindⅢ雙酶切PCR產物和PGL3-basic質粒，純化回收酶切產物，用T4連接酶鏈接后，轉化至E.coli，經雙酶切鑒定及DNA序列分析，篩選陽性克隆，構建重組質粒pGL3-basic/Daxx-1~-695nt、Daxx-1~-161nt與Daxx-161~-695nt。
　　(3)將質粒pGL3-basic、pGL3-basic/Daxx-1~-695n t、pGL3-

4、basic/Daxx-1~-161nt、pGL3-basic/Daxx-161~-695nt分別單獨轉染，或與質粒pcDNA3.1(-)/HPV16 E6共轉染Hela細胞，24h和48h后，裂解細胞，收集上清液，加入熒光素酶試劑，熒光測定儀檢測相對熒光強度。
　　(4)分別將質粒pEGFP-c1和pEGFP-c1/Daxx瞬時轉染Hela細胞，24h和48h后分別裂解細胞提取總RNA，以質粒pcDNA3.1(-)/HPV16 E

5、6作為內參標準品進行絕對熒光定量PCR反應，分析HPV16 E6基因的拷貝數(shù)。
　　結果：
　　(1)在HPV16 E6抗體沉淀的染色質免疫復合物中，PCR擴增到Daxx基因片段。
　　(2) Daxx啟動子截斷片段均正確地連入載體pGL3-basic，即成功構建了熒光素酶報告基因載體pGL3-basic/Daxx-1~-695nt、Daxx-1~-161nt和Daxx-161~-695nt。
　　(3)質粒pG

6、L3-basic/Daxx-1~-695nt、Daxx-1~-161nt和Daxx-161~-695nt能在Hela細胞激活Daxx-1~-695nt和Daxx-1~-161nt和Daxx-161~-695nt啟動子活性，在共轉染質粒pcDNA3.1(-)/E6的Hela細胞，下調Daxx-1~-695nt、和Daxx-1~-161nt和Daxx-161~-695nt啟動子活性，且啟動子Daxx-161~-695nt活性最低。
　

7、　(4)在pEGFP-c1與pEGFP-c1/Daxx轉染的Hela細胞均有綠色熒光蛋白表達。GFP高表達時，HPV16 E6基因的復制水平未出現(xiàn)顯著變化；融合蛋白GFP-Daxx高表達時， HPV16 E6基因的復制水平下調。
　　結論：
　　(1) HPV16 E6能結合Daxx DNA啟動子-1~-161nt。
　　(2)構建的質粒 pGL3-basic/Daxx-1~-695nt、 pGL3-basic/Dax