HPV18-E6基因siRNA對喉癌細(xì)胞的生長影響.pdf

1、目的：人乳頭狀瘤病毒(HPV)早期區(qū)域中的E6基因是其最主要的編碼癌蛋白的癌基因之一，且文獻(xiàn)報(bào)道，HPV-E6基因與喉癌細(xì)胞的永生化有關(guān)。本研究擬采用RNA干涉的方法封閉喉癌細(xì)胞系Hep-2中HPV-E6基因表達(dá),探討其表達(dá)下調(diào)對喉癌細(xì)胞的增殖活性影響,進(jìn)一步分析該基因與喉癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系,為喉癌基因治療篩選新的靶標(biāo)。
　　方法：（1）PCR擴(kuò)增survivin啟動(dòng)子，回收擴(kuò)增產(chǎn)物并替換用Ambion公司pSilencer-4.

2、1載體cmv啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)針對HPV18-E6基因的siRNA兩對并分別構(gòu)建針對HPV18-E6基因的siRNA真核表達(dá)載體,酶切和測序鑒定。（2）以攜帶HPV18-E6基因的人喉癌Hep－2細(xì)胞系為靶細(xì)胞，應(yīng)用PCR的方法方法得到HPV18-E6基因，回收其片斷，并且連接入pGEM-T-Easy載體，測序鑒定，命名為E6-T-Easy。再用此質(zhì)粒作為模版，構(gòu)建一個(gè)real-timePCR體系所需要得標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，命名為E6’-T-Easy

3、。（3）以攜帶HPV18-E6基因的人喉癌Hep－2細(xì)胞系為靶細(xì)胞，通過陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體,并用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。（4）Realtime PCR和Westernblot方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞HPV18-E6基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。（5）MTT檢測細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞增殖周期的改變。
　　結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了人HPV18-E6基因的RNA干涉真核表達(dá)載體命名為pSilencer4.1-Sur

4、pneo-E1和pSilencer4.1-Surpneo-E2。經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定正確；（2）成功從喉癌Hep-2細(xì)胞系中克隆出HPV18-E6基因全長片段，經(jīng)酶切鑒定和測序鑒定與genebank所提供的序列一致；（3）干涉載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，篩選出HPV18-E6基因mRNA和蛋白均表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染喉癌細(xì)胞系；（4）E6基因的表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞增殖活性明顯下降；（5）E6基因的表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞比例增加最高達(dá)30.4％,同