抑制人類宮頸癌細胞HPV16 E6-E7基因活性的siRNA表達載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：構(gòu)建能抑制HPV16E6/E7基因活性的穩(wěn)定表達siRNA的重組載體。為進一步研究其干擾系統(tǒng)對HPV16E6/E7基因活性的抑制作用打下基礎(chǔ)，也給我們以后研究HPV16E6/E7基因的功能以及宮頸癌的基因治療提供了新的技術(shù)和方法。 方法：①應(yīng)用美國Oligoengine公司的targetsiRNAdesigntools設(shè)計軟件設(shè)計并化學(xué)合成各60個堿基的編碼短發(fā)夾RNA序列的、分別靶向HPV16E6/E7基因的寡核苷酸正反

2、義鏈。②將寡核苷酸正反義單鏈進行退火形成雙鏈。③BglⅡ、HindⅢ雙酶切處理pSUPER.Retro逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。④將酶切后的載體和退火后的雙鏈寡核苷酸進行體外連接構(gòu)建重組載體，同時設(shè)立陰性對照。⑤采用1×TSS兩步法將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM109，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，用堿裂解法提取。⑥用EcoRⅠ-HindⅢ雙酶切鑒定陽性克隆，同時以空質(zhì)粒做陰性對照。⑦PCR鑒定陽性克隆，引物應(yīng)用DNAStar設(shè)計軟件設(shè)計。⑧測序鑒定陽性克隆。

3、 結(jié)果：①BglⅡ、HindⅢ雙酶切處理后的pSUPER.Retro載體經(jīng)過電泳鑒定證明酶切成功。分別切出7.3Kb和0.9Kb大小的片斷。②重組構(gòu)建的pSUPER.Retro-16E6和pSUPER.Retro-16E7載體經(jīng)EcoRⅠ-HindⅢ雙酶切電泳分析可產(chǎn)生7.1Kb和281bp大小的兩條DNA條帶，而在空質(zhì)粒的泳道出現(xiàn)7.1Kb和1204bp大小的兩條DNA條帶。③DNAStar設(shè)計軟件設(shè)計引物，重組載體用PCR方法