東海原甲藻增殖細(xì)胞核抗原基因表達(dá)量與生長關(guān)系的研究.pdf

1、浮游藻是海洋食物鏈的重要一環(huán)，在能量轉(zhuǎn)移和營養(yǎng)鹽循環(huán)等方面起著重要作用。對浮游藻現(xiàn)場生長率等基本生理生態(tài)學(xué)參數(shù)的測定，是估算浮游藻生產(chǎn)力、研究浮游藻種群變遷、構(gòu)建生態(tài)動力學(xué)模型乃至赤潮預(yù)測的基礎(chǔ)，特別是現(xiàn)場測定單種浮游藻的生長率顯得尤為重要。但目前尚缺乏一種準(zhǔn)確估算單一種類浮游藻現(xiàn)場生長率的方法。近年來，國際上對細(xì)胞周期標(biāo)志物的研究顯示，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)可能

2、在浮游藻生長率研究中有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，這為藻類生長率的估算提供了新的研究方向。 本研究以我國東海海域常見的赤潮藻-東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)為研究對象，首次克隆得到了東海原甲藻的PCNA基因和其細(xì)胞色素b基因的cDNA全長序列，分別設(shè)計(jì)了符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測要求的引物和TaqMan探針，建立了檢測東海原甲藻PCNA與Cytb基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，系統(tǒng)研究了東海原甲藻PCNA基

3、因表達(dá)量在不同細(xì)胞周期中的變化及其與生長率之間的關(guān)系，為運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)東海原甲藻現(xiàn)場生長率的估算奠定了基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： (1)通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)，首次克隆得到了東海原甲藻長為1057bp的PCNA基因的cDNA全長序列和長為1124bp的細(xì)胞色素b(cytochrome b，Cyt b)基因的cDNA全長序列，并分別對PCNA和Cyt b進(jìn)行了序列

4、比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。 (2)根據(jù)得到的PCNA與Cyt b基因序列，分別設(shè)計(jì)了符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RFQ-PCR)檢測要求的引物和TaqMan探針，并以12種藻為參照藻，對所設(shè)計(jì)PCNA基因的RFQ-PCR引物的特異性進(jìn)行了分析。采用SYBR GreenⅠ染料和TaqMan探針兩種熒光體系建立了檢測東海原甲藻PCNA與Cyt b基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用SYBR GreenⅠ染料體系得到的曲線方程分別為：對

5、PCNA，y=-3.403x+40.048，(r=0.999，其中x為細(xì)胞數(shù)對數(shù)值，y為CT值，r為相關(guān)系數(shù))；對Cyt b，y=-3.501x+39.351，(r=0.999)；采用TaqMan探針體系得到的曲線方程分別為：對PCNA，y=-3.211x+39.302，(r=0.999)；對Cyt b，y=-3.340x+41.041，(r=0.997)。通過對標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測，驗(yàn)證了所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。 (3)運(yùn)用建立的

6、定量PCR方法，系統(tǒng)研究了東海原甲藻PCNA基因表達(dá)量在不同細(xì)胞周期中的變化及其與生長率之間的關(guān)系。結(jié)果表明，Cyt b基因表達(dá)穩(wěn)定，平均單細(xì)胞表達(dá)量為(45.4±4.7)拷貝，在不同的生長階段表達(dá)量變化很小，是一個(gè)潛在的良好的內(nèi)參基因。與此不同，平均單細(xì)胞中PCNA表達(dá)量在培養(yǎng)的不同階段變化較大，指數(shù)期的含量比平臺期高4倍左右，說明PCNA表達(dá)量與細(xì)胞分裂密切相關(guān)。以Cytb基因?yàn)閮?nèi)參基因，PCNA基因?yàn)槟康幕?，進(jìn)一步研究了不同培養(yǎng)

7、條件下PCNA基因的相對表達(dá)量(REL)與生長率之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，REL與生長率呈正相關(guān)性。 (4)以流式細(xì)胞術(shù)分析了同步培養(yǎng)的東海原甲藻的細(xì)胞周期，以RFQ-PCR測定了PCNA基因表達(dá)量，研究了不同細(xì)胞周期中PCNA基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明，同其他物種的PCNA類似，東海原甲藻PCNA表達(dá)與細(xì)胞周期相關(guān)，表達(dá)量從G1后期開始升高，在S期表達(dá)量最高。 本研究為建立PCNA相對表達(dá)量與東海原甲藻生長率之間的關(guān)系，