中肋骨條藻增殖細(xì)胞核抗原基因表達(dá)量與生長關(guān)系的研究.pdf

1、對浮游藻現(xiàn)場生長率等基本生理生態(tài)學(xué)參數(shù)的測定，是估算浮游藻類生產(chǎn)力、研究浮游藻種群變遷、構(gòu)建生態(tài)動力學(xué)模型乃至赤潮預(yù)測的基礎(chǔ)，但目前還缺乏一種準(zhǔn)確估算單一種類浮游藻現(xiàn)場生長率的技術(shù)方法。近年來，國際上對細(xì)胞周期標(biāo)志物的研究顯示，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)可能在浮游藻生長率研究中有巨大的潛在應(yīng)用價值，這為藻類生長率的估算提供了新的研究視角。 本研究以中國近海常見

2、的赤潮藻--中肋骨條藻(Skeletonema costatum)為研究對象，建立了有效提取中肋骨條藻RNA的方法，進(jìn)而通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)獲得了其PCNA基因的部分序列，首次克隆測序得到了714bp的中肋骨條藻細(xì)胞色素b(cytochrome b，Cytb)基因序列，并分別建立了PCNA系統(tǒng)關(guān)系樹和Cyt系統(tǒng)關(guān)系樹。進(jìn)一步地，根據(jù)得到的PCNA與Cyt b基因序列，分別設(shè)計了符合實時熒

3、光定量PCR(RFQ-PCR)檢測要求的引物和TaqMan探針，建立了檢測中肋骨條藻PCNA與Cyt b基因的實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線方程分別為：對PCNA，y=-3.055x+41.093(r=0.999,其中x為細(xì)胞數(shù)對數(shù)值，y為C<,T>值，R為相關(guān)系數(shù))：對Cyt b，y=-4.0x+44.96(r= 0.997)。以16種藻為參照藻，對所設(shè)計PCNA的RFQ-PCR引物的特異性進(jìn)行了驗證，并通過對已知濃度樣品的檢測

4、證明了所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。 以上述建立的系列試驗研究方法為基礎(chǔ)，系統(tǒng)研究了中肋骨條藻生長率與增殖細(xì)胞核抗原基因表達(dá)量之間的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，平均單細(xì)胞中PCNA表達(dá)量在培養(yǎng)的不同階段變化很大，且變化趨勢與生長率表現(xiàn)出良好的一致性，說明PCNA表達(dá)量與細(xì)胞分裂密切相關(guān)，體現(xiàn)了其作為細(xì)胞增殖指標(biāo)的潛能；而Cyt b基因表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)量變化很小，說明Cyt b基因是一個潛在的良好的內(nèi)參基因?；诖?，本研究提出可以PCNA為目的基