增殖細胞核抗原在臍血CD34+造血干-祖細胞中的表達及意義.pdf

1、人臍血富含造血干/祖細胞,是骨髓與外周血以外的另一種有廣闊應(yīng)用前景的造血細胞來源。近年,臍血移植已廣泛地用于治療兒童白血病和惡性腫瘤等。然而,由于單份臍血的采集量有限,其中所含造血干/祖細胞數(shù)量難以滿足大齡兒童及成人患者的需要。造血干細胞體外擴增技術(shù)有望克服這一障礙。臍血造血干/祖細胞有很強的增殖分化能力,在造血細胞因子的刺激下可大量增殖,但在擴增同時造血干/祖細胞也不可避免地分化成熟,從而影響了其自我更新能力和多向分化潛能的保留。因此

2、,如何能既擴增造血細胞數(shù)量又盡可能保留造血細胞性能則是當(dāng)前研究的重點。近年,在細胞因子組合方案方面進行了大量研究,仍未建立一條確切有效的途徑,而對于細胞周期調(diào)控的研究甚少,但作為機體細胞,造血干細胞增殖分化的根本仍是細胞周期的演進,造血干細胞增殖分化進程不但受控于細胞因子,同時與細胞周期調(diào)控因子密切相關(guān)。
　　增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是重要的細胞周期調(diào)控蛋白,

3、能促使細胞由G1期進入S期。本研究采用流式細胞儀技術(shù)對不同培養(yǎng)時間和不同培養(yǎng)條件下臍血CD34+細胞中PCNA的表達水平和細胞周期進行了測定,揭示PCNA在造血調(diào)控中的重要生物學(xué)意義,為進一步研究如何通過調(diào)控PCNA來控制造血干細胞的增殖和分化提供一定的研究基礎(chǔ)。
　　1.臍血CD34+細胞在體外擴增中PCNA表達水平的變化
　　采用Mini MACS(magnetic activated cell sorting)分離獲得

4、CD34+細胞,培養(yǎng)于含有不同細胞因子組合的IMDM( Iscove’s modified Dulbecco’s medium,IMDM)培養(yǎng)體系中。實驗分組:①無細胞因子組即空白對照組;②干細胞因子(stem cell factor,SCF)+白細胞介素6(IL-6)+白細胞介素3(IL-3)組;③SCF+IL-6+IL-3+血小板生成素(Thrombopoietin,Tpo)組;④Flt3-配基(Flt3-ligand,FL)+Tp

5、o+SCF+IL-6+IL-3組。在培養(yǎng)的第3天、5天、7天收集細胞,流式細胞儀檢測PCNA表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),新鮮分離的臍血中CD34+細胞低表達PCNA,陽性率為(11.6±5.2)％,在體外短期培養(yǎng),無細胞因子的組合PCNA表達水平逐漸下降,而在含有各細胞因子組合的培養(yǎng)體系中,PCNA表達水平逐漸增高,其中以FL+Tpo+SCF+IL-6+IL-3組合作用最顯著。
　　2.臍血CD34+細胞在體外擴增中細胞周期的變化。

6、>　　采用Mini MACS分離獲得CD34+細胞,在含有不同細胞因子組合(①SCF+IL-6+IL-3組;②SCF+IL-6+IL-3+Tpo組;③FL+Tpo+SCF+IL-6+IL-3組)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)7天,在0天、3天、7天收集細胞,碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色后運用流式細胞儀檢測細胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn),新鮮分離的臍血CD34+細胞95.1%處于G0/G1期,僅4.9%處于S期,在不同細胞因子組合下培養(yǎng)3