東海原甲藻磷脅迫響應基因的分析及細胞死亡相關基因的克隆與分析.pdf

1、本文構建了對數(shù)生長期東海原甲藻的cDNA文庫。使用mRNAPurification Kit MagExtractor -mRNA-提取純化對數(shù)生長期東海原甲藻poly(A)<'+>RNA，使用Super SMART<'TM>PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒將poly(A)<'+> RNA逆轉錄為單鏈cDNA并進行PCR擴增，然后將cDNA連接到pMD 18-T vector載體上，并電轉化至感受態(tài)細胞E coli JM

2、109。結果顯示，感受態(tài)細胞電轉化轉化效率大于10<'9>，并且，絕大部分插入片斷大小在500-1500bp之間。使用此種方法，使我們能夠對微量東海原甲藻細胞(細胞數(shù)小于10<'5>個細胞)構建cDNA文庫。 以正常磷酸鹽營養(yǎng)濃度培養(yǎng)條件下的東海原甲藻為對照組，使用cDNA-AFLP技術對磷脅迫下的東海原甲藻的表達情況進行了分析。通過AFLP分析，共分離了50條表達差異條帶，最后到43條有效序列。網上BLAST分析結果顯示，其中

3、8條序列搜尋到匹配序列，而剩余的35條序列則未搜尋到匹配序列。以β-actin為參照基因，進一步對其中的三個基因片斷進行了表達差異分析，結果表明，在受到磷酸鹽脅迫時，這三個片斷所代表基因的表達量全部有所增加，并且與對照相比，差異顯著。其中，基因片段TDF72(antioxidant，AhpC/Tsa family)的表達量在磷脅迫時是對照組的1.24倍(p=0.04)；TDF68(dual-specificity protein pho

4、sphatase)是對照組的1.60倍(p=0.002)TDF85(Phosphoglycerate/bisphosphoglycerate mlatase)是對照組的2.30倍(p=0.0001)。通常認為，單細胞浮游藻是"不死"的，除非是被捕食、或者被病毒或細菌感染致死、或者是受到物理損傷、或者是永久的、不可逆轉的沉降到海洋深處。然而，以往研究資料顯示，當細胞受到環(huán)境脅迫時，在單細胞真核浮游植物中也存在類似細胞程序化死亡的現(xiàn)象。通過

5、顯微觀察，觀測到了衰老東海原甲藻細胞破裂死亡現(xiàn)象，衰老階段的東海原甲藻細胞死亡是否也是一種主動地死亡呢?在衰老東海原甲藻表達序列標簽(EST)分析中發(fā)現(xiàn)了部分才caspase編碼基因序列，克隆了東海原甲藻caspase編碼基因的全長cDNA序列，序列分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸全長520bp，包含一個258bp的開放閱讀框(open reading flame，0RF)，編碼一個85氨基酸多肽，其5'非翻譯區(qū)長135 bp，3'非翻譯區(qū)長127

6、bp，并在其3'非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)一個poly(A)+加尾信號(AATAA)。以β-actin為參照基因，我們進一步對其在衰老東海原甲藻細胞中的表達情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)：在各個衰老階段的東海原甲藻細胞中存在Caspase基因表達，并且其表達存在顯著差異。在開始階段，Caspase基因的表達量逐漸增加，到第6天時，達到最大值0.689(是第0天的19倍)；之后，其表達量逐漸降低，到第9天時，不能檢測到任何基因的表達。結果表明衰老東海原甲藻細胞的