TCF21的SUMO化對(duì)ERα介導(dǎo)的雌激素信號(hào)通路的調(diào)控.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是嚴(yán)重威脅女性健康和生命的主要疾患。長(zhǎng)時(shí)間的雌激素暴露是乳腺癌發(fā)病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。雌激素通過與雌激素受體(Estrogenreceptors，ERs)相結(jié)合發(fā)揮其生理功能。ERs包括ERα和ERβ兩種不同的亞型。其中，ERα可以介導(dǎo)雌激素的促增殖作用，已成為激素依賴的乳腺癌治療的重要靶點(diǎn)之一。因此，鑒定對(duì)ERα功能具有調(diào)控作用的分子可以促進(jìn)乳腺癌治療策略的發(fā)展。轉(zhuǎn)錄因子21(Transcription

2、factor21,TCF21)是一種腫瘤抑制因子。有研究表明，TCF21可以與雄激素受體(Androgen receptor，AR)相互作用，并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，而ERα和AR都屬于核受體轉(zhuǎn)錄因子家族，具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)。因此，推測(cè)TCF21對(duì)ERα的功能也具有調(diào)控作用。
　　小泛素相關(guān)修飾((Small ubiquitin.related modifier，SUMO)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，對(duì)蛋白質(zhì)的功能具有重

3、要的調(diào)控作用。目前，對(duì)TCF21的翻譯后修飾研究的比較少，僅發(fā)現(xiàn)其可被磷酸化修飾。通過蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，TCF21含有兩個(gè)潛在的SUMO化位點(diǎn)，因此推測(cè)TCF21可能也被SUMO化修飾。本論文從TCF21與ERα的相互作用，及TCF21的SUMO化入手，探討了TCF21的SUMO化對(duì)ERα介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)理。本研究的主要內(nèi)容如下:
　　1.通過谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶拉下(Glutathione S-transferase pul

4、l-down，GSTpull-down)實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜實(shí)驗(yàn)，研究了TCF21和ERα之間是否存在相互作用。結(jié)果表明，TCF21和ERα存在相互作用，并且TCF21與ERα的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain，DBD)結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合。
　　2.TCF21是一種腫瘤抑制因子，可以通過招募組蛋白去乙?；?(Histonedeacetyl

5、ase1,HDAC1)抑制AR的轉(zhuǎn)錄活性。接下來通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)TCF21對(duì)ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果表明，TCF21能夠以劑量依賴的方式抑制ERα的轉(zhuǎn)錄活性，并且HDACs參與到了這個(gè)過程之中。反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription-PCR, RT-PCR)和免疫印跡(Western blotting，WB)實(shí)驗(yàn)表明，TCF21能夠抑制ERα下游靶基因細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和早老素2(Presen

6、ilin-2,pS2)的mRNA及蛋白水平。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)實(shí)驗(yàn)表明，TCF21作為ERα的輔抑制因子，結(jié)合在ERα下游靶基因pS2的啟動(dòng)子之上。
　　3.通過蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，TCF21含有兩個(gè)潛在的SUMO化位點(diǎn)，表明TCF21可能是SUMO化修飾的底物。通過免疫印跡和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明，TCF21可以被SUMO1修飾，第24位賴氨酸是唯一的SUMO化

7、位點(diǎn)，小類泛素修飾特異性蛋白酶1(Sentrin-specific protease1,SENP1)主要介導(dǎo)了TCF21的去SUMO化過程。
　　4.SUMO化修飾具有調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位、蛋白-蛋白相互作用，以及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性等作用。通過免疫印跡、免疫共沉淀、IP-reIP、免疫熒光和核質(zhì)分離等實(shí)驗(yàn)，研究了SUMO化修飾對(duì)TCF21功能的影響。結(jié)果表明，SUMO化可以增強(qiáng)TCF21的蛋白穩(wěn)定性，及其與HDAC1/2的

8、相互作用，而不影響其與ERα的相互作用和在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。
　　5.進(jìn)一步通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，研究了TCF21的SUMO化對(duì)ERα的轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果表明，SUMO化能夠增強(qiáng)TCF21對(duì)ERα轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。通過MTT比色法、結(jié)晶紫染色以及流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TCF21的SUMO化對(duì)ERα陽性乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)TCF21的SUMO化能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。
　　本研究首次將TCF21與ERα聯(lián)系起來，并