雌激素通過(guò)MAPK信號(hào)通路刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的增值和遷移.pdf

1、目的：觀察絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及其亞族細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulated protein kinase ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)、p38在雌激素刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)遷移和增值中的作用。方法：(1)單個(gè)核細(xì)胞的分離:用50U/ml肝素2ml潤(rùn)濕空針后抽取臍帶血約50ml,加入3％明膠16ml(臍帶血:明膠=3:1)沉淀后加入人淋巴

2、細(xì)胞分離液用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞,活力計(jì)算活性達(dá)98％可以接種。(2)誘導(dǎo)分化:成纖維細(xì)胞多于24小時(shí)內(nèi)貼壁,因此培養(yǎng)24小時(shí)后取未貼壁細(xì)胞以4×106/cm2接種于包被有纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)板(每孔lml),每孔中加入M199培養(yǎng)液lml,添加10％胎牛血清、1％青鏈霉素(1萬(wàn)單位/ml)、 VEGF(50ng/ml),置于5％CO2、飽和濕度37℃孵育箱中培養(yǎng),換培養(yǎng)液培養(yǎng)至7d,貼壁細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。(3)EPCs鑒定:

3、培養(yǎng)細(xì)胞爬片后,然后分別加入鼠抗人 CD133單克隆抗體(1:100稀釋)、DiI-ac-LD、FITC-UEA-1分別在倒置相差顯微鏡及免疫熒光顯微鏡下觀察拍照。(4)實(shí)驗(yàn)分組:本實(shí)驗(yàn)共分五組,分別為對(duì)照組:正常培養(yǎng)EPCs未加入任何藥物;雌二醇(E2)組:EPCs培養(yǎng)7天后加入 E2;PD98,059(ERK抑制劑)組:培養(yǎng)7天后先用PD98,059作用細(xì)胞24h再加入E2;SP600125(JNK抑制劑)組:培養(yǎng)7天后先用SP60

4、0125作用細(xì)胞24h再加入 E2;SB203580(p38抑制劑)組:培養(yǎng)7天后先用SB203580作用細(xì)胞24h再加入E2。(5)觀測(cè)指標(biāo):①酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各組活細(xì)胞數(shù)(結(jié)果以吸光值表示)。②選取特定濃度用流式細(xì)胞檢測(cè)儀分析各組細(xì)胞周期變化。③將細(xì)胞懸液種在Traswell小室上層,下層加入趨化因素,觀察由上層小室遷入下層小室的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：(1)單個(gè)核細(xì)胞分離:從臍帶血中分離的單個(gè)核細(xì)胞在顯微鏡下呈圓形、透亮,臺(tái)盼藍(lán)染色顯示存

5、活率>95％。(2)EPCs鑒定:取培養(yǎng)第7天的細(xì)胞做免疫熒光檢測(cè)CD133呈綠色,陽(yáng)性率達(dá)95％以上。取培養(yǎng)第9天的細(xì)胞檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體 Dil-ac-LDL呈紅色,FITC-UAE-1呈綠色,Dil-ac-LDL和FITC-UAE-1雙染的細(xì)胞為 EPCs呈現(xiàn)黃色。染色結(jié)果顯示黃色細(xì)胞>90％。(3)酶聯(lián)免疫檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:對(duì)照組的吸光值為0.4163±0.0503,E2組吸光值為0.6940±0.0143,與對(duì)照組相比

6、有顯著意義(P<0.05),說(shuō)明E2可以引起EPCs增值;PD98,059在5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/L吸光值分別為0.7406±0.0376、0.6177±0.1043、0.5211±0.0793、0.5032±0.0975、0.4522±0.0406,與E2組比較PD98,059在20umol/L、40umol/L、80umol/L時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明PD98

7、,059可以阻斷 E2引起的EPCs增值;SP600125在1umol/L、25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L吸光值分別為0.6152±0.0406、0.4255±0.0395、0.3882±0.0185、0.4090±0.0761、0.4168±0.1012,與E2組相比SP600125在25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明S

8、P600125可以阻斷E2引起的EPCs增值; SB203580在5umol/L、10umol/L、15umol/L、20umol/L、25umol/L吸光值分別為0.6670±0.6223、0.6350±0.8311、0.6312±0.6437、0.6285±0.6462、0.6500±0.6036,與 E2組相比所有濃度均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期:E2組S期所占比例為(33.15±0.212)％與

9、對(duì)照組(11.55±0.212)％相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明 E2可以刺激EPCs增值;PD98,059組S期比例(16.25±6.434)％與E2組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明其可以阻斷 E2引起的EPCs增值;SP600125組 S期比例(12.55±1.202)％與 E2組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明其可以阻斷 E2引起的EPCs增值;而SB203580組S期所占比例為(24.80±6.223)％與

10、E2相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),表明其不能減弱E2生物學(xué)效應(yīng)。另外E2組G1期細(xì)胞比例為(34.45±0.495)％與對(duì)照組(62.90±4.384)％相比P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, PD98,059組G1期細(xì)胞比例為(57.40±7.640)％與E2組相比P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SP600125組G1期細(xì)胞比例為(53.95±1.344)％與E2組相比P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SB203580組(44.75±1.630)％與

11、E2組相比P>0.05沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,上述結(jié)果與各組S期比較結(jié)果一致。(5)Traswell遷移實(shí)驗(yàn):對(duì)照組下層細(xì)胞數(shù)為22.80±8.643;E2在濃度為1×10-8 mol/L時(shí)下層細(xì)胞數(shù)為65.20±12.617,與對(duì)照組比較有顯著性增加(P<0.05),表明 E2可以促進(jìn) EPCs的遷移能力;PD98,059在5umol/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、80umol/L濃度時(shí)下層細(xì)胞數(shù)分別為54.00±

12、11.576、42.40±7.057、42.00±7.416、29.40±5.640、22.80±5.263,與 E2組相比 PD98,059在20umol/L、40umol/L、80umol/L濃度時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明PD98,059可以阻斷 E2的促遷移能力;SP600125在1umol/L、25umol/L、50umol/L、75umol/L、100umol/L濃度時(shí)下層細(xì)胞數(shù)分別為56.00±12.390、44.

13、00±9.027、50.40±14.484、51.80±17.513、68.40±5.320,與E2組相比SP600125在25umol/L、50umol/L、75umol/L時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明 SP600125也可以阻斷 E2的促遷移能力;SB203580在5umol/L、10umol/L、15umol/L、20umol/L、25umol/L濃度時(shí)下層細(xì)胞數(shù)分別為62.40±7.830、59.40±11.330、55