褪黑素在蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷中抗壞死性凋亡和抗神經(jīng)炎癥的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage，SAH)是一種高死亡率、高致殘率的神經(jīng)外科急癥。動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血是SAH最常見的類型，約占全部病例的85％。在過去很長的一段時(shí)間里，遲發(fā)性腦血管痙攣一直被認(rèn)為是引起SAH患者預(yù)后不良的主要原因，然而在近20年的研究中，該研究方向并沒有取得突破性進(jìn)展，越來越多的證據(jù)表明SAH后除遲發(fā)性腦血管痙攣外，還存在其他重要的機(jī)制造成SAH患者預(yù)后不良。近年來，領(lǐng)

2、域內(nèi)的權(quán)威專家提出了早期腦損傷(EarlyBrain Injury，EBI)概念，即從SAH開始至72小時(shí)這一時(shí)間窗之內(nèi)的腦損傷。EBI是一個(gè)非常復(fù)雜的病理生理過程，所涉及的分子機(jī)制十分復(fù)雜，包括炎癥因子的釋放、氧化應(yīng)激的產(chǎn)生、谷氨酸的毒性作用、脂質(zhì)過氧化、鈣離子通道的開放、細(xì)胞凋亡或壞死等。截止目前，大量動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，神經(jīng)細(xì)胞死亡和神經(jīng)炎癥反應(yīng)是EBI的兩大主要損傷機(jī)制。
　　褪黑素是一種由松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，易滲透

3、血腦屏障(Blood BrainBarrier，BBB)，具有良好的生物耐受性。近年來，褪黑素逐漸被證明可以通過減少氧化應(yīng)激，抑制炎癥反應(yīng)，激活自噬和抑制凋亡等多種機(jī)制在SAH疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而，這其中涉及的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。
　　因此，本研究將從抑制EBI兩大主要損傷機(jī)制，即抗細(xì)胞死亡及抗神經(jīng)炎癥兩個(gè)方面對褪黑素在SAH中的保護(hù)機(jī)制展開研究。第一部分研究將著眼于壞死性凋亡這種新型的細(xì)胞死亡方式，觀察壞死性凋

4、亡機(jī)制是否參與了SAH的致病過程，并且進(jìn)一步探討褪黑素治療對于壞死性凋亡的作用及其可能機(jī)制。第二部分研究主要著眼于褪黑素調(diào)控NLRP3炎癥小體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分
　　1.采用線栓穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）模型，成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)被分為假手術(shù)組（Sham組）和蛛網(wǎng)膜下腔出血組（SAH組）。SAH組按取材時(shí)間不同又分為蛛網(wǎng)膜下腔出血后6h組（SAH6

5、h組）、蛛網(wǎng)膜下腔出血后12h組（SAH12h組）、蛛網(wǎng)膜下腔出血后24h組（SAH24h組）、蛛網(wǎng)膜下腔出血48h組（SAH48h組）和蛛網(wǎng)膜下腔出血后72h組（SAH72h組），通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測各組SD大鼠同側(cè)大腦皮質(zhì)內(nèi)RIPK3蛋白含量;通過雙重免疫熒光染色觀察RIPK3的細(xì)胞定位;通過碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色鑒定壞死神經(jīng)細(xì)胞及其與RIPK3的關(guān)系;通過透射電子顯微鏡(Transmission

6、ElectronMicroscope，TEM)觀察壞死神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　2.成年雄性SD大鼠隨機(jī)被分為假手術(shù)+溶劑組（Sham組），蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組（SAH+溶劑組），蛛網(wǎng)膜下腔出血+GSK872處理組（SAH+GSK872組），根據(jù)各分組不同的藥物治療情況，SAH模型建立后30分鐘，應(yīng)用立體定位下側(cè)腦室注射法分別給予溶劑或RIPK3抑制劑GSK872，SAH后72小時(shí)通過免疫熒光等方法評估各組的細(xì)胞死亡，腦水腫

7、和神經(jīng)功能等情況。
　　3.成年雄性SD大鼠隨機(jī)被分為假手術(shù)+溶劑組（Sham組），蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組（SAH+溶劑組），蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素處理組（SAH+Mel組），根據(jù)各分組不同的藥物治療情況，SAH模型建立后2小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，分別給予溶劑或褪黑素腹腔注射，SAH后72小時(shí)通過蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光等方法評估各組相關(guān)蛋白的表達(dá)，細(xì)胞死亡，腦水腫和神經(jīng)功能等情況。
　　4.成年雄性SD大鼠隨機(jī)被分為蛛網(wǎng)

8、膜下腔出血+溶劑組（SAH+溶劑組），蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素處理組（SAH+Mel組），蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素+3-MA處理組（SAH+Mel+3-MA組），根據(jù)各分組不同的藥物治療情況，SAH模型建立前20分鐘，給予腦室內(nèi)注射溶劑或3-MA，術(shù)后2小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)，給予溶劑或褪黑素腹腔注射，SAH后72小時(shí)通過蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光等方法評估各組相關(guān)蛋白的表達(dá)，細(xì)胞死亡，腦水腫和神經(jīng)功能等情況。
　　第二部分
　

9、　采用線栓穿刺法制作蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）模型，成年雄性SD大鼠隨機(jī)被分為假手術(shù)+溶劑組（Sham組），蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑組（SAH+溶劑組），蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素處理組（SAH+Mel組）和蛛網(wǎng)膜下腔出血+褪黑素+3-MA處理組（SAH+Mel+3-MA組），根據(jù)各分組不同的標(biāo)準(zhǔn)，SAH模型建立前20分鐘，給予腦室內(nèi)注射溶劑或3-MA，術(shù)后2小時(shí)給予溶劑或褪黑素腹腔注射。24小時(shí)后獲取大腦標(biāo)本，通過腦含水量檢測、活性氧測定、蛋白

10、免疫印跡、免疫組織化學(xué)和透射電子顯微鏡等方法檢測線粒體自噬、NLRP3炎癥小體等相關(guān)指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　1.SD大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后6個(gè)小時(shí)，腦組織中RIPK3的表達(dá)升高，12小時(shí)出現(xiàn)一個(gè)較小幅度的下降，接著再度上升，在72小時(shí)到達(dá)峰值。
　　2.通過PI染色及透射電鏡觀察到大鼠腦組織在蛛網(wǎng)膜下腔出血后72小時(shí)出現(xiàn)壞死的神經(jīng)元，且RIPK3主要位于神經(jīng)元中。
　　3.褪黑素能降低RIPK3

11、和MLKL的表達(dá)，并減少壞死神經(jīng)元的數(shù)量及HMGB1的釋放。褪黑素能通過減少血腦屏障的破壞而減輕水腫，從而能夠在蛛網(wǎng)膜下腔出血72小時(shí)后改善神經(jīng)功能。
　　4.自噬抑制劑3-MA能逆轉(zhuǎn)褪黑素對于緩解RIPK-3介導(dǎo)的壞死性凋亡的作用。
　　第二部分
　　1.SAH后褪黑素治療上調(diào)線粒體自噬相關(guān)蛋白(PINK1/Parkin)，減輕線粒體損傷，減少ROS產(chǎn)生。
　　2.SAH后褪黑素治療抑制NLRP3炎癥小體激活，

12、減少炎癥反應(yīng)。
　　3.SAH后褪黑素治療減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡，減輕腦水腫和緩解神經(jīng)功能障礙。
　　4.自噬抑制劑3-MA預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)褪黑素治療對于NLRP3炎癥小體活化的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.本研究證實(shí)RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡與SAH的早期腦損傷有關(guān)。褪黑素能減輕RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡，減少HMGB1胞漿易位、保護(hù)血腦屏障及減輕腦水腫，從而改善SAH后的神經(jīng)功能。而這其中潛在的機(jī)制可能與自噬的激活