基于深度測(cè)序和生物信息學(xué)分析的衣藻小RNA研究.pdf

1、小RNA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，通過(guò)形成RISC復(fù)合體作用于目標(biāo)序列在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)基因，進(jìn)而影響著發(fā)育定時(shí)、抗病毒防御、基因組重排、染色體修飾等生物過(guò)程。目前在擬南芥、水稻等高等植物中都有大量脅迫響應(yīng)方面的研究，但是單細(xì)胞藻類(lèi)衣藻中一直沒(méi)有關(guān)于小RNA和脅迫關(guān)系的報(bào)導(dǎo)。
　　 本課題中，我們借助高通量測(cè)序探索了這一聯(lián)系，并進(jìn)行了后繼的生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。衣藻細(xì)胞在缺硫、缺磷、缺銅、銅過(guò)量、強(qiáng)光照、高二氧化碳、黑

2、暗共7種情況下培養(yǎng)，并以TAP和HS培養(yǎng)液中的細(xì)胞作為對(duì)照，然后用于Solexa測(cè)序。去除樣品準(zhǔn)備時(shí)引入的載體之后，原始數(shù)據(jù)被按照長(zhǎng)度過(guò)濾并且檢測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量。這一步預(yù)處理說(shuō)明，大多數(shù)樣品測(cè)序時(shí)產(chǎn)生序列都超過(guò)400萬(wàn)條。其它支持?jǐn)?shù)據(jù)質(zhì)量的參數(shù)還包括比對(duì)到基因組上的序列比例(多于40％)、典型小RNA長(zhǎng)度～20-22nt處的富集程度(＞84%)、比對(duì)到miRNA前體和基因組重復(fù)序列區(qū)的序列含量(分別超過(guò)14%和30%)。
　　 剩余的

3、序列用于我們實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的miRNA預(yù)測(cè)工具，這一工具對(duì)高拷貝和有鏈主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的序列進(jìn)行擴(kuò)展以找到滿(mǎn)意的二級(jí)結(jié)構(gòu)。該過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了34個(gè)可能的miRNA，其中2個(gè)有miRNA*。對(duì)其熱力學(xué)穩(wěn)定性作隨機(jī)檢驗(yàn)表明，衣藻的新miRNA并不像動(dòng)物中那樣有p值數(shù)值的傾向性。對(duì)新發(fā)現(xiàn)的miRNA使用傳統(tǒng)的靶基因預(yù)測(cè)方法，我們發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)著19個(gè)miRNA的54個(gè)注釋的靶基因。這些靶基因分為三類(lèi)，即轉(zhuǎn)錄因子(如EF-3)、各種酶(如甲基化轉(zhuǎn)移酶)、以及直接起作

4、用的分子(如鞭毛相關(guān)蛋白)。
　　 小RNA的表達(dá)特點(diǎn)則從三個(gè)角度探討，并且該過(guò)程中強(qiáng)調(diào)對(duì)miRNA的分析。使用UPGMA算法，我們把miRNA富集量層次聚類(lèi)為5類(lèi)(TAP對(duì)照)和6類(lèi)(HS對(duì)照)。接著，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間還進(jìn)行了兩兩比較。另外，借助一種稱(chēng)作對(duì)應(yīng)分析的統(tǒng)計(jì)方法，我們發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個(gè)可能的根據(jù)脅迫特異性表達(dá)的miRNA。而對(duì)于siRNA，作出的基因組分布圖在樣本間呈現(xiàn)出相似的表達(dá)輪廓，這也和進(jìn)一步的相關(guān)性分析相一致(相

5、關(guān)系數(shù)～0.70-0.96)。
　　 我們還對(duì)miRNA表達(dá)變化作了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并使用一種先進(jìn)的技術(shù)(降解組測(cè)序)確認(rèn)了部分miRNA靶基因，該技術(shù)通過(guò)深度測(cè)序抓取和定量切割片段。Northern Blot用于缺磷時(shí)上升的miRNA雜交，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)cr.057241、cr.05507_2、cre-miR912三者過(guò)表達(dá)；從有限的注釋資源了解到，它們的靶基因參與蛋白質(zhì)修飾、鞭毛運(yùn)動(dòng)和氮代謝。此外，降解組測(cè)序提供了另一種理解miRNA