基于深度測序和生物信息學分析的衣藻小RNA研究.pdf

1、小RNA是近年來新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，通過形成RISC復合體作用于目標序列在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)基因，進而影響著發(fā)育定時、抗病毒防御、基因組重排、染色體修飾等生物過程。目前在擬南芥、水稻等高等植物中都有大量脅迫響應(yīng)方面的研究，但是單細胞藻類衣藻中一直沒有關(guān)于小RNA和脅迫關(guān)系的報導。
　　 本課題中，我們借助高通量測序探索了這一聯(lián)系，并進行了后繼的生物信息學分析和實驗驗證。衣藻細胞在缺硫、缺磷、缺銅、銅過量、強光照、高二氧化碳、黑

2、暗共7種情況下培養(yǎng)，并以TAP和HS培養(yǎng)液中的細胞作為對照，然后用于Solexa測序。去除樣品準備時引入的載體之后，原始數(shù)據(jù)被按照長度過濾并且檢測數(shù)據(jù)質(zhì)量。這一步預(yù)處理說明，大多數(shù)樣品測序時產(chǎn)生序列都超過400萬條。其它支持數(shù)據(jù)質(zhì)量的參數(shù)還包括比對到基因組上的序列比例(多于40％)、典型小RNA長度～20-22nt處的富集程度(＞84%)、比對到miRNA前體和基因組重復序列區(qū)的序列含量(分別超過14%和30%)。
　　 剩余的

3、序列用于我們實驗室內(nèi)的miRNA預(yù)測工具，這一工具對高拷貝和有鏈主導優(yōu)勢的序列進行擴展以找到滿意的二級結(jié)構(gòu)。該過程中發(fā)現(xiàn)了34個可能的miRNA，其中2個有miRNA*。對其熱力學穩(wěn)定性作隨機檢驗表明，衣藻的新miRNA并不像動物中那樣有p值數(shù)值的傾向性。對新發(fā)現(xiàn)的miRNA使用傳統(tǒng)的靶基因預(yù)測方法，我們發(fā)現(xiàn)了對應(yīng)著19個miRNA的54個注釋的靶基因。這些靶基因分為三類，即轉(zhuǎn)錄因子(如EF-3)、各種酶(如甲基化轉(zhuǎn)移酶)、以及直接起作

4、用的分子(如鞭毛相關(guān)蛋白)。
　　 小RNA的表達特點則從三個角度探討，并且該過程中強調(diào)對miRNA的分析。使用UPGMA算法，我們把miRNA富集量層次聚類為5類(TAP對照)和6類(HS對照)。接著，實驗組和對照組之間還進行了兩兩比較。另外，借助一種稱作對應(yīng)分析的統(tǒng)計方法，我們發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個可能的根據(jù)脅迫特異性表達的miRNA。而對于siRNA，作出的基因組分布圖在樣本間呈現(xiàn)出相似的表達輪廓，這也和進一步的相關(guān)性分析相一致(相

5、關(guān)系數(shù)～0.70-0.96)。
　　 我們還對miRNA表達變化作了實驗驗證，并使用一種先進的技術(shù)(降解組測序)確認了部分miRNA靶基因，該技術(shù)通過深度測序抓取和定量切割片段。Northern Blot用于缺磷時上升的miRNA雜交，實驗中發(fā)現(xiàn)cr.057241、cr.05507_2、cre-miR912三者過表達；從有限的注釋資源了解到，它們的靶基因參與蛋白質(zhì)修飾、鞭毛運動和氮代謝。此外，降解組測序提供了另一種理解miRNA