利用Ion Torren測序平臺和生物信息學分析幾株細菌和病毒基因組.pdf

1、病毒，一種特殊的生命體，具有嚴格的活細胞寄生的生存方式，可寄生在人、動植物、昆蟲、真菌和細菌等細胞中而引起感染。75％的人類傳染病由病毒引起。
　　病毒的一個增殖周期包括:通過識別宿主細胞表面受體而進入宿主或將遺傳物質(zhì)注入宿主（噬菌體）、以自身核酸為模板合成子代遺傳物質(zhì)，子代蛋白的轉錄、子代病毒顆粒的包裝、從宿主體內(nèi)釋放、新的宿主細胞的再感染。
　　噬菌體，作為細菌病毒，其復制周期與病毒類似。dsDNA噬菌體基因組利用末端重

2、復序列進行環(huán)化，從而通過滾環(huán)復制方式(rolling circle replication)復制出許多多聯(lián)體DNA(concatemeric DNA)，以該DNA為底物，包裝酶對其進行識別和切割，進而產(chǎn)生子代基因組DNA，包裝進頭部蛋白(prohead)，最終得到子代病毒顆粒。在這個過程中，復制和組裝對噬菌體和病毒至關重要。因此，該過程的研究對病毒學的發(fā)展具有關鍵作用。復制和組裝與病毒基因組的末端序列密切相關，復制過程需要通過末端進行環(huán)

3、化，從而起始復制，包裝通過切割產(chǎn)生子代DNA的末端，從而決定下一代的復制，因此，對病毒基因組末端的研究至關重要。而傳統(tǒng)的末端研究方法需大量人力和時間，且易丟失細節(jié)。因此，迫切需要尋找一種通量高、準確度高及快速的末端分析方法。
　　虹彩病毒(iridovirus)，雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于虹彩病毒科。被其感染的個體在受到斜射光照射時，會呈現(xiàn)出紫色或者藍色的彩虹，而得名。屬于虹彩病毒科的虹彩病毒屬和綠虹彩病毒屬為無脊椎動物虹彩病毒II

4、Vs，主要感染昆蟲。IIVs對昆蟲可導致亞致死以及誘導細胞凋亡。同時，其也可用于殺蟲劑。目前，對該病毒的功能及其與宿主的相互作用等研究較少;其次， Genbank上只有4珠IIVs的全基因組序列，因此，迫切需要對更多IIVs進行全基因測序，從而為該病毒科的遺傳研究及各方面的功能研究提供指導。
　　炭疽桿菌，是全球傳播的嚴重的人畜共患病——炭疽病的病原體。同時，也是恐怖主義和生物武器的病原體。1993年日本炭疽桿菌氣溶膠襲擊事件和2

5、001年美國炭疽桿菌信件事件，都為快速準確的分型方法的產(chǎn)生提供了挑戰(zhàn)。需要一種分型方法來區(qū)分一次疫情是由炭疽桿菌的自然爆發(fā)或是恐怖主義對微生物的故意釋放，從而對不同緊急事件進行不同的處理。
　　然而，炭疽桿菌具有非常高的種間基因組同源性，以及非常低的多樣性，即使經(jīng)歷了20至40代的“感染—死亡—感染”循環(huán)后，其基因組的遺傳組成幾乎保持不變，因此分型非常困難。
　　目前具有兩種有效的分型方法，單堿基多態(tài)性(SNP: singl

6、e nucleotidepolymorphism)和多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(MLVA: multiple locusvariable number tandem repeat analysis)，這兩種方法具有較高的分辨率，大大的增強了炭疽桿菌株間的辨別。但SNP具有偏向性(bias)且在很接近的株間存在較少，MLVA方法分析結果不穩(wěn)定，不同的實驗室得到結果具有較大差異，因此，迫切需要尋找一種分辨率更高，更準備的炭疽分型方法以及

7、炭疽溯源方法，來處理炭疽引起的嚴重的事件如傳染病和恐怖事件。
　　摩氏摩根菌為革蘭氏陰性厭氧菌，是腸桿菌科摩根菌屬唯一菌種，可對多種β-內(nèi)酰胺類型的抗生素呈現(xiàn)固有耐藥，是可引起嚴重感染的條件致病菌，常引起院內(nèi)感染，包括泌尿道感染和術后感染及多種炎癥。國內(nèi)外報道該菌感染的發(fā)病率逐年增多。其已經(jīng)成為醫(yī)院里獲得性感染的常見致病菌之一。
　　高通量測序技術(HTS，high-throughput sequencing)具有通量高、準

8、確性高、快速等特點，且成本越來越低。因此，已經(jīng)被廣泛運用到了生物研究的各個領域，例如，對有參考序列的物種的重測序(resequencing)、對無參考序列的基因組的從頭測序、為探測未知病毒對特定長度的小RNA的測序、為探測基因的表達量對轉錄組進行測序。
　　目前主流高通量測序平臺包括Illumina的Miseq和Hiseq2000、Roche454及Life technology的Ion Torrent。Illumina公司的測序

9、儀準確度高，通量大，因而被使用最多，但其運行時間較長、讀長較短。454雖具有較長讀長，但成本卻很高。Ion Torrent測序平臺具有速度快和成本低的特點，可被用來對病毒和細菌進行全基因組測序。
　　我們通過對噬菌體和病毒基因組高通量測序結果的分析，確定了測序結果中存在的高頻序列(HFS)是病毒基因組末端序列。采用本實驗室建立的生物信息學分析方法，我們利用HFS數(shù)據(jù):i）可以同時獲得病毒全基因組和末端序列;ii）建立了一個判定每個

10、病毒基因組末端類型和包裝機制的標準;iii）鑒定額外的關于病毒基因組末端序列的細節(jié)特征，如末端重復、次要末端及多個末端等;iv）T4類噬菌體的基因組被末端酶切割時是以一種序列傾向性的方法進行而非完全隨機，修正了之前的相關報道;v) N4類噬菌體具有獨特的末端特征，即左側均一，右側具有2組不同的異質(zhì)性末端。利用這個技術，我們首次鑒定出了金黃色葡萄球菌噬菌體基因組左側末端均一，而右側末端隨機的特性。另外，我們也提出了病毒基因組重復序列長度的

11、計算公式。我們的結果簡化了傳統(tǒng)末端分析的流程。理論上，這個方法可進一步用到植物和動物病毒基因組末端研究，以及其他小的基因組。本文第一章的研究展示了一個快捷的、有效的末端分析方法，這將為病毒復制、包裝、末端酶功能、轉錄調(diào)控以及宿主和病毒代謝的研究提供有力支持。
　　虹彩病毒AMIV分離自2012年從云南收集的蚊子研磨勻漿。將勻漿加入C3/36細胞系進行培養(yǎng)，并觀察細胞病變CPE，盲傳三代后仍能觀察到CPE，因而確定為陽性分離結果。而

12、后進行擴大培養(yǎng)，濃縮和純化后提取基因組，進行shotgun和matepair高通量測序，通過生物信息學分析，i）獲得全基因組序列;ii)經(jīng)BLAST分析鑒定為虹彩病毒:iii）經(jīng)過比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)其與已知的虹彩病毒序列非常不同;iv）經(jīng)過分子進化分析發(fā)現(xiàn)其為新的虹彩病毒基因型;v)利用透射電鏡發(fā)現(xiàn)其為標準的二十面體結構，具有直徑為180nm的蛋白外殼，為有包膜病毒，vi）利用熒光顯微鏡獲得了詳細的CPE過程，即9小時便可致細胞病變，

13、36小時可讓全部細胞裂解，提示該病毒可作為病蟲害的殺蟲劑，vii）通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)AMIV基因組上，存在末端冗余序列(TR)，約基因組的10％，TR序列保證了每個病毒顆粒從親代DNA那兒至少獲得一個拷貝的每個基因，在進化上具有優(yōu)勢，viii）對AMIV快速復制機制進行分析，發(fā)現(xiàn)了保守的與宿主DNA復制或轉錄有關的bro-like基因，且具有12個拷貝，文獻報道具有快速復制能力的囊泡病毒具有多個拷貝的bro-like基因，因此這提示

14、其可能與AMIV快速復制相關;另外，通過對AMIV基因組進行功能注釋，一共發(fā)現(xiàn)54個功能已知的基因，這其中與復制相關的基因就有20個，約占功能已知基因的40％，這保證基DNA復制高效進行，這可能是該病毒快速復制的另一個原因。
　　2012年8月，遼寧省爆發(fā)了炭疽疫情，該疫情致7人和上百頭牛感染，一株從死牛身上分離到的毒株han和當?shù)厮靡呙缰陃ac，動物實驗結果顯示，二者對小鼠毒性都很低，因此有人懷疑本次疫情是由炭疽疫苗株引起。為

15、驗證該假設，我們對兩株炭疽桿菌進行了高通量測序。利用高通量測序，我們對這兩株細菌進行了關鍵位點SNP(canonical SNP)分型，結果顯示，毒株han和疫苗株vac是完全不同的兩株細菌。利用MLVA分型發(fā)現(xiàn)han株與已報道的中國本土株聚為一類，但同時，又具有其獨自的進化分支，故為一株新發(fā)的中國本土株。另外，我們還提出了具有比傳統(tǒng)分型方法更高分辨率的基于序列的MLVA(sequence-based MLVA)分型方法，利用該方法驗證