鹽地堿蓬陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體SsHKT1的基因克隆及其功能分析.pdf

1、鉀是植物中的重要元素，高親和性的K<'+>吸收系統(tǒng)在鉀的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。植物HKT蛋白與原核生物中的KtrB、TrkH及KdpA轉(zhuǎn)運(yùn)載體、真菌中的Trk蛋白共同組成了一個(gè)超級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族，HKT蛋自已經(jīng)引起廣泛的注意，其功能逐漸被揭示。研究表明HKT轉(zhuǎn)運(yùn)載體在長(zhǎng)距離的Na<'+>轉(zhuǎn)運(yùn)及植物耐鹽性中起重要作用。目前報(bào)道的HKT基因大都來(lái)自非鹽生植物如小麥、擬南芥、水稻及桉樹(shù)等，只有McHKT1和McHKT2來(lái)自兼性CAM植物冰

2、葉日中花。有關(guān)鹽生植物中HKT轉(zhuǎn)運(yùn)載體的特性及功能研究的數(shù)據(jù)非常有限。本實(shí)驗(yàn)以典型的積鹽型鹽生植物鹽地堿蓬(Suaeda salsa L．)為材料，研究了鹽地堿蓬中K<'+>、Na<'+>的吸收特性；克隆了鹽地堿蓬質(zhì)膜陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體SsHKT1的基因并進(jìn)行了表達(dá)特性的分析，同時(shí)構(gòu)建了含有SsHKT1的酵母表達(dá)載體和植物表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化高親和性K<'+>吸收缺陷的酵母突變體CY162、Na<'+>敏感的酵母突變體G19和野生型擬南芥，以

3、分析此基因在不同的異源表達(dá)系統(tǒng)中所表現(xiàn)的主要功能及過(guò)量表達(dá)對(duì)擬南芥耐鹽性的影響。主要結(jié)果總結(jié)如下： 1、低K<'+>條件下NaCl脅迫不影響鹽地堿蓬中的K<'+>含量K<'+>營(yíng)養(yǎng)在鹽地堿蓬生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。無(wú)NaCl脅迫(0 mmol/L NaCl)和NaCl脅迫(100，400 mmol/L)下，鹽地堿蓬葉片和根系中的K<'+>含量均隨K<'+>處理濃度的增加而顯著增加。此外，較高K<'+>(0.7，1，6 mmol/L)濃

4、度時(shí)，NaCl脅迫造成植株葉片、根系K<'+>含量明顯下降。但較低K<'+>(0，0.1 mmol/L)濃度條件下，NaCl脅迫對(duì)葉片和根系的K<'+>的含量幾乎沒(méi)有影響；而且，在根中，無(wú)論是在低K<'+>濃度條件還是在高K<'+>濃度條件下，400 mmol/L NaCl脅迫與100 mmol/L NaCl脅迫相比，并沒(méi)有使鹽地堿蓬根中的K<'+>含量明顯下降。由此可以看出，在鹽脅迫下鹽地堿蓬具有較高的維持K<'+>穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，這與非

5、鹽生植物明顯不同，而K<'+>穩(wěn)態(tài)對(duì)鹽地堿蓬的耐鹽性具有重要作用。 2、K<'+>吸收系統(tǒng)抑制劑對(duì)鹽地堿蓬中Na<'+>積累的效應(yīng)在較低K<'+>濃度(0，0．1，0．4 mmol/L)條件下，高親和K<'+>吸收系統(tǒng)抑制劑NEM(3 mmol/L)處理對(duì)鹽地堿蓬植株內(nèi)Na<'+>積累影響不大，Na<'+>積累并沒(méi)有降低。這說(shuō)明Na<'+>可能不是通過(guò)高親和K<'+>吸收系統(tǒng)進(jìn)入鹽地堿蓬體內(nèi)的。在較高K<'+>濃度(6，8，10

6、mmol/L)條件下，低親和K<'+>吸收系統(tǒng)抑制劑TEA(6 mmol/L)對(duì)鹽地堿蓬體內(nèi)Na<'+>積累具有顯著影響，它明顯抑制了Na<'+>的吸收和積累(P<,鹽處理VS鹽處理+TEA><0.05)。這說(shuō)明Na<'+>可以通過(guò)低親和K<'+>吸收通道進(jìn)入鹽地堿蓬體內(nèi)，TEA對(duì)低親和K<'+>吸收系統(tǒng)的抑制也同時(shí)抑制了Na<'+>的吸收。 3、鹽地堿蓬中陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體SsHKTl cDNA的克隆及序列分析根據(jù)GeneBank

7、中已知的HKT類蛋白的cDNA和蛋白序列尋找保守區(qū)并合成簡(jiǎn)并引物，用低K<'+>溶液處理鹽地堿蓬幼苗16 h，提取根的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條中間片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序并進(jìn)行Blast分析與HKT的同源性較高。根據(jù)中間片段利用5’、3’RACE分別合成其5’、3’端序列，最終得到一條完整的HKT類基因，命名為SsHKT1。SsHKT1的cDNA(GenBank accessionNo．AY530754)序

8、列全長(zhǎng)2033 bp，包括54 bp的5’-非編碼區(qū)和332 bp的3’-非編碼區(qū)。開(kāi)放閱讀框?yàn)?650bp，編碼550個(gè)氨基酸殘基，分子量約63.0 kD，SsHKT1氨基酸序列與其他植物HKT蛋白具有39％～64％的同源性。在SsHKT1的一級(jí)結(jié)構(gòu)中推測(cè)的第一個(gè)P-環(huán)的GYG基序的第一個(gè)Gly并不存在，而是由Ser所替代。SsHKT1氨基酸序列的疏水性分析表明鹽地堿蓬質(zhì)膜SsHKT1為一跨膜多肽，存在10個(gè)可能的跨膜區(qū)。 4

9、、鹽地堿蓬根中SsHKT1的亞細(xì)胞定位利用制備的SsHKT1的抗體SsHKT1<,Δ135-204>進(jìn)行鹽地堿蓬根細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜蛋白的免疫印跡雜交，發(fā)現(xiàn)SsHKT1蛋白分布在根細(xì)胞質(zhì)膜上。 5、低K<'+>條件下鹽地堿蓬SsHKT1基因的表達(dá)特性分析t分離鹽地堿蓬植株的根、莖、葉總RNA，用半定量RT-PCR分析SsHKT1表達(dá)的組織特異性發(fā)現(xiàn)，SsHKT1主要在葉中表達(dá)，其次是根，在莖中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)；在葉和根中SsHKT1

10、的表達(dá)明顯受到低K<'+>條件的誘導(dǎo)；在低K<'+>處理初期隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽地堿蓬葉片SsHKT1基因表達(dá)量增加，到48小時(shí)達(dá)到最大，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽地堿蓬葉片SsHKT1基因表達(dá)量有所降低，但仍明顯高于對(duì)照；較老的苗子中低K<'+>條件對(duì)于此基因的誘導(dǎo)作用弱于幼嫩的鹽地堿蓬苗。這表明低K<'+>條件下，鹽地堿蓬中SsHKT1基因表達(dá)存在動(dòng)態(tài)變化。 6、鹽脅迫條件下鹽地堿蓬SsHKT1基因的表達(dá)特性分析在低K<'+>條件

11、下同時(shí)用200 mmol/L、400 mmol/L NaCl處理鹽地堿蓬48小時(shí)，鹽地堿蓬葉片SsHKT1表達(dá)量比單獨(dú)用低K<'+>處理時(shí)增加，但兩種鹽濃度處理樣品之間差別不大。 7、SsHKT1在酵母突變體中主要轉(zhuǎn)運(yùn)K<'+>而非Na<'+>酵母突變體CY162由于缺失高親和性K<'+>轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因Trk1和Trk2而在低K<'+>培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)；突變體G19中負(fù)責(zé)編碼Na<'+>外排的ATPases的ENA1～4基因缺失，

12、造成Na<'+>敏感性增加，將SsHKT1利用LiAc轉(zhuǎn)化方法分別轉(zhuǎn)到酵母突變體CY162和G19中，發(fā)現(xiàn)CY162(SsHKT1)能在低K<'+>培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而G19(SsHKT1)對(duì)Na<'+>的敏感性并未增加，初步說(shuō)明SsHKT1主要轉(zhuǎn)運(yùn)K<'+>而非Na<'+>。 8、過(guò)量表達(dá)SsHKT1能夠增加轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐鹽性過(guò)量表達(dá)鹽地堿蓬SsHKT1基因的擬南芥植株比野生型擬南芥植株耐鹽性增加。在正常MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因

13、植株的生長(zhǎng)與野生型植株沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明外源基因的插入和過(guò)量表達(dá)并沒(méi)有影響植物的正常生長(zhǎng)。在含不同濃度NaCI的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株其葉色、根發(fā)育均明顯好于野生型植株。將在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10天的野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到0mmol/KK<'+>或含不同濃度LiCl的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)兩周，轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)明顯好于野生型植株。正常生長(zhǎng)條件及不同處理的轉(zhuǎn)基因土培苗地上部分的K<'+>積累明顯高于野生型，而Na<'+

14、>積累在兩者之間沒(méi)有明顯差異。 綜上所述，實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，SsHKT1在酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)主要轉(zhuǎn)運(yùn)K<'+>而非Na<'+>；過(guò)量表達(dá)鹽地堿蓬K<'+>轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SsHKT1明顯提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性，這與酵母中的表達(dá)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)SsHKT1在維持正常的胞質(zhì)K<'+>水平及植物抗鹽性，方面具有重要作用，為利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行作物耐鹽新品種的培育奠定了一定基礎(chǔ)。 本論文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)： 1、首次從鹽生植