鹽地堿蓬SsHKT1基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析.pdf

1、土壤鹽漬化是影響作物生長(zhǎng)及產(chǎn)量的主要非生物脅迫，NaCl是引起鹽脅迫的首要因子，植物在鹽脅迫中保持高K+/Na+比對(duì)植物的耐鹽性有密切關(guān)系。植物HKT家族在植物耐鹽方面的作用受到廣泛關(guān)注。目前關(guān)于擬南芥、小麥、水稻等非鹽生植物HKT1的研究很多，主要認(rèn)為植物中HKT1蛋白在植物體內(nèi)Na+運(yùn)輸和Na+穩(wěn)態(tài)維持中起到重要作用。近年來，鹽生植物耐鹽機(jī)制的研究也受到越來越多的重視。對(duì)于鹽芥、鹽地堿蓬等鹽生植物HKT1的研究也有了一定進(jìn)展，研究表

2、明，鹽生植物HKT1蛋白更傾向于K+的吸收，這與非鹽生植物HKT1蛋白明顯不同。研究鹽生植物HKT1對(duì)于進(jìn)一步揭示植物耐鹽機(jī)制有重要作用。
　　本實(shí)驗(yàn)室采用真鹽生植物鹽地堿蓬為材料已經(jīng)克隆了SsHKT1，證明SsHKT1運(yùn)K+而不運(yùn)Na+，SsHKT1表達(dá)受低K+和NaCl處理誘導(dǎo)，而且SsHKT1表達(dá)在高鹽處理下保持高水平。為了探討SsHKT1調(diào)控的分子機(jī)理及SsHKT1在植物耐鹽方面的作用，本實(shí)驗(yàn)克隆了SsHKT1啟動(dòng)子，對(duì)啟

3、動(dòng)子特性及活性進(jìn)行了初步探索，另外還對(duì)鹽地堿蓬SsHKT1在水稻中的功能進(jìn)行初步研究，主要研究結(jié)果如下:
　　1.SsHKT1基因啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增
　　根據(jù)已發(fā)表的SsHKT1 cDNA序列，設(shè)計(jì)了一系列嵌套的特異性引物，以鹽地堿蓬基因組DNA為模板，經(jīng)三次TAIL-PCR后克隆得到啟動(dòng)子序列1044 bp，經(jīng)BLAST比對(duì)后確定序列為鹽地堿蓬SsHKT1啟動(dòng)子序列。
　　2.SsHKT1基因啟動(dòng)子的序列元件分析

4、>　　用PLACE和PlantCARE對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明啟動(dòng)子序列中除含有TATA-box、CAAT-box等啟動(dòng)子典型順式調(diào)控元件外，還含有一些重要的順式調(diào)控元件:如NaCl誘導(dǎo)元件GT-1、防御和逆境響應(yīng)元件TC-rich repeats、光誘導(dǎo)相關(guān)元件GATA-box和G-box、分裂組織表達(dá)相關(guān)元件CAT-box、胚乳特異相關(guān)元件Skn-1-motif等特異性表達(dá)元件。
　　3.SsHKT1基因啟動(dòng)子的活性及表

5、達(dá)分析
　　用BamHⅠ和PstⅠ雙酶切SsHKT1啟動(dòng)子，導(dǎo)入含有GUS表達(dá)基因的PCAMBIA1391載體中，取代載體中的35 S啟動(dòng)子，構(gòu)建了SsHKT1啟動(dòng)子-GUS載體。
　　將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，選取陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化煙草葉片，對(duì)葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果表明，鹽地堿蓬SsHKT1啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草葉片中表達(dá)，證明SsHKT1啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子活性。
　　用含有SsHKT1啟動(dòng)子-GUS

6、載體的農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序，用50 mg/L的潮霉素對(duì)擬南芥種子進(jìn)行篩選。對(duì)篩選出的抗性植株進(jìn)行GUS染色分析，結(jié)果顯示GUS基因主要在擬南芥的維管組織中表達(dá)。
　　4. SsHKT1基因轉(zhuǎn)化水稻分析
　　將成熟的水稻種子置于NBD2培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出的愈傷于NBD0.5培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。將PROKⅡ-SsHKT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，取陽(yáng)性克隆侵染水稻愈傷組織。用50 mg/L的G418試劑對(duì)愈傷進(jìn)行篩選，獲得抗性愈傷。