堿蓬、鹽角草超氧化物歧化酶(SOD)基因的克隆和功能分析.pdf

1、土壤鹽漬化嚴重影響農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量，是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一。我國是世界鹽堿地大國之一，鹽堿地分布廣泛，面積約0.346億hm2。因此，如何利用和開發(fā)這些鹽堿地資源，提高作物產(chǎn)量已成為迫切需要解決的問題。目前，通過生物技術(shù)方法分離植物耐鹽基因并在轉(zhuǎn)基因植物中表達，培育耐鹽作物新品種，已經(jīng)成為改良土壤鹽堿地的有效手段。超氧化物歧化酶(SOD)是一種廣泛存在于動植物、微生物中的金屬酶，是機體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的重要抗氧化酶類。研究發(fā)現(xiàn)

2、，植物體內(nèi)SOD酶活性的高低和植物的抗逆性密切相關，而且過表達SOD基因能明顯提高植物對鹽脅迫的抵御能力。本論文選取堿蓬、鹽角草和鹽芥三種鹽生植物為材料，采用RACE技術(shù)分別克隆出堿蓬和鹽角草Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因，并進行序列分析；構(gòu)建原核表達載體，并在大腸桿菌中表達；將重組菌在不同NaCl濃度的液體LB培養(yǎng)基中誘導表達，通過測定OD600值來分析5個SOD基因的耐鹽功能。研究結(jié)果如下：
　　 1.通過簡并引物擴增

3、和RACE技術(shù)，分別克隆出堿蓬和鹽角草Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因。堿蓬Mn-SOD(GenBank注冊號：JQ061157)全長為1050bp，開放閱讀框長699bp，推測編碼233個氨基酸，分子量約為25.9KDa，其氨基酸序列與陸地棉、橡膠樹的序列相似性為84％。轉(zhuǎn)運肽和亞細胞定位分析表明其可能為線粒體SOD基因。堿蓬Cu/Zn-SOD基因(GenBank注冊號：JQ061159)全長為843bp，開放閱讀框為459bp，

4、推測編碼153個氨基酸，分子量約為15.1KDa。其蛋白序列與菠菜Cu/Zn-SOD序列相似性高達94％，與冰葉日中花細胞質(zhì)Cu/Zn-SOD蛋白序列相似性為92％。鹽角草Mn-SOD基因(GenBank注冊號：JQ061158)全長為1053bp，開放閱讀框長699bp，推測編碼233個氨基酸，分子量約為25.7KDa。其氨基酸序列與陸地棉的序列相似性為83％，與紫桿柳的序列相似性為81％。轉(zhuǎn)運肽和亞細胞定位分析表明其可能為線粒體SO

5、D基因。鹽角草Cu/Zn-SOD基因(GenBank注冊號：JQ061160)全長為985bp，開放閱讀框為684bp，推測編碼228個氨基酸，分子量約為23.2KDa，蛋白序列與菠菜Cu/Zn-SOD序列相似性達81％。轉(zhuǎn)運肽分析表明其可能為葉綠體SOD基因。
　　 2.根據(jù)獲得的堿蓬、鹽角草SOD基因和鹽芥Mn-SOD基因(EF140719)序列設計引物擴增編碼區(qū)，并在引物上引入NdeI和EcoRV酶切位點。構(gòu)建原核表達載體

6、pET30a/SsCSD、pET30a/SsMSD、pET30a/SeCSD、pET30a/SeMSD和pET30a/ThMSD，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE)進行誘導表達。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)蛋白條帶大小與預期一致，目的蛋白均成功表達。
　　 3.考慮到高濃度IPTG會對重組菌生長產(chǎn)生抑制作用，我們對IPTG濃度進行優(yōu)化，以確保SOD基因既能夠表達，又不影響重組菌的生長狀況。通過實驗我們選取0.025mM