堿蓬、鹽角草超氧化物歧化酶(SOD)基因的克隆和功能分析.pdf

1、土壤鹽漬化嚴(yán)重影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一。我國(guó)是世界鹽堿地大國(guó)之一，鹽堿地分布廣泛，面積約0.346億hm2。因此，如何利用和開(kāi)發(fā)這些鹽堿地資源，提高作物產(chǎn)量已成為迫切需要解決的問(wèn)題。目前，通過(guò)生物技術(shù)方法分離植物耐鹽基因并在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，培育耐鹽作物新品種，已經(jīng)成為改良土壤鹽堿地的有效手段。超氧化物歧化酶(SOD)是一種廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中的金屬酶，是機(jī)體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的重要抗氧化酶類(lèi)。研究發(fā)現(xiàn)

2、，植物體內(nèi)SOD酶活性的高低和植物的抗逆性密切相關(guān)，而且過(guò)表達(dá)SOD基因能明顯提高植物對(duì)鹽脅迫的抵御能力。本論文選取堿蓬、鹽角草和鹽芥三種鹽生植物為材料，采用RACE技術(shù)分別克隆出堿蓬和鹽角草Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因，并進(jìn)行序列分析；構(gòu)建原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中表達(dá)；將重組菌在不同NaCl濃度的液體LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)測(cè)定OD600值來(lái)分析5個(gè)SOD基因的耐鹽功能。研究結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增

3、和RACE技術(shù)，分別克隆出堿蓬和鹽角草Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因。堿蓬Mn-SOD(GenBank注冊(cè)號(hào)：JQ061157)全長(zhǎng)為1050bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)699bp，推測(cè)編碼233個(gè)氨基酸，分子量約為25.9KDa，其氨基酸序列與陸地棉、橡膠樹(shù)的序列相似性為84％。轉(zhuǎn)運(yùn)肽和亞細(xì)胞定位分析表明其可能為線(xiàn)粒體SOD基因。堿蓬Cu/Zn-SOD基因(GenBank注冊(cè)號(hào)：JQ061159)全長(zhǎng)為843bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?59bp，

4、推測(cè)編碼153個(gè)氨基酸，分子量約為15.1KDa。其蛋白序列與菠菜Cu/Zn-SOD序列相似性高達(dá)94％，與冰葉日中花細(xì)胞質(zhì)Cu/Zn-SOD蛋白序列相似性為92％。鹽角草Mn-SOD基因(GenBank注冊(cè)號(hào)：JQ061158)全長(zhǎng)為1053bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)699bp，推測(cè)編碼233個(gè)氨基酸，分子量約為25.7KDa。其氨基酸序列與陸地棉的序列相似性為83％，與紫桿柳的序列相似性為81％。轉(zhuǎn)運(yùn)肽和亞細(xì)胞定位分析表明其可能為線(xiàn)粒體SO

5、D基因。鹽角草Cu/Zn-SOD基因(GenBank注冊(cè)號(hào)：JQ061160)全長(zhǎng)為985bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?84bp，推測(cè)編碼228個(gè)氨基酸，分子量約為23.2KDa，蛋白序列與菠菜Cu/Zn-SOD序列相似性達(dá)81％。轉(zhuǎn)運(yùn)肽分析表明其可能為葉綠體SOD基因。
　　 2.根據(jù)獲得的堿蓬、鹽角草SOD基因和鹽芥Mn-SOD基因(EF140719)序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增編碼區(qū)，并在引物上引入NdeI和EcoRV酶切位點(diǎn)。構(gòu)建原核表達(dá)載體

6、pET30a/SsCSD、pET30a/SsMSD、pET30a/SeCSD、pET30a/SeMSD和pET30a/ThMSD，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)蛋白條帶大小與預(yù)期一致，目的蛋白均成功表達(dá)。
　　 3.考慮到高濃度IPTG會(huì)對(duì)重組菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，我們對(duì)IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化，以確保SOD基因既能夠表達(dá)，又不影響重組菌的生長(zhǎng)狀況。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們選取0.025mM