花生鐵螯合酶1基因的克隆及其在鹽脅迫下的功能分析.pdf

1、花生(Arachis hypogaeaL.)是我國(guó)乃至世界上重要的油料作物之一，因含有豐富的油脂和蛋白質(zhì)而具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。工業(yè)污染加劇以及農(nóng)業(yè)灌溉措施和化肥使用量的不當(dāng)?shù)戎T多原因，造成次生鹽堿地面積日益擴(kuò)大，已經(jīng)并將繼續(xù)威脅旱作花生的種植區(qū)，嚴(yán)重影響了花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，如何保證花生的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)成為育種的重大目標(biāo)和技術(shù)難題。為了實(shí)現(xiàn)這一宏達(dá)的目標(biāo)，加速花生品種的改良進(jìn)程，研究者逐漸將研究方向轉(zhuǎn)移至耐鹽分子機(jī)理的

2、研究，以期通過(guò)基因工程技術(shù)手段對(duì)現(xiàn)有品種進(jìn)行遺傳改良，選育出耐鹽的花生新品種，為提高花生產(chǎn)量和品質(zhì)提供實(shí)際應(yīng)用的參考價(jià)值。
　　鐵螯合酶催化亞鐵血紅素的合成，為呼吸鏈中的復(fù)合物以及過(guò)氧化物酶提供輔基。研究表明，亞鐵血紅素很可能作為一種溝通質(zhì)體和細(xì)胞核的信號(hào)分子，參與干旱等逆境脅迫的響應(yīng)。本課題意在克隆花生鐵螯合酶1基因并研究其在鹽脅迫下的功能。我們以擬南芥鐵螯合酶1基因(AtFC1,GI:145358447)為探針，比對(duì)搜索NCB

3、I中花生EST數(shù)據(jù)庫(kù)獲得兩條同源的EST序列并予以拼接，根據(jù)拼接后的序列設(shè)計(jì)引物，以鹽脅迫處理的花生葉片為試材，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得花生鐵螯合酶1基因，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)，通過(guò)在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)其與綠色熒光蛋白(GFP)的融合基因確定其在細(xì)胞中的位置，并通過(guò)在煙草中過(guò)表達(dá)該基因研究其在鹽脅迫響應(yīng)中的功能。研究結(jié)果如下:
　　(1)從鹽脅迫處理的花生葉片中克隆獲得完整的花生鐵螯合酶1基因的c

4、DNA序列，命名為AhFC1,已在Genbank注冊(cè)為KU560625。該基因cDNA序列全長(zhǎng)為1965 bp，5'端非翻譯區(qū)為157bp，開放閱讀框長(zhǎng)1449 bp，3'端非翻譯區(qū)為359 bp，編碼的蛋白質(zhì)含482個(gè)氨基酸。
　　(2)采用多種方法對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)AhFC1蛋白具有高度保守的鐵螯合酶N端和C端結(jié)構(gòu)域，在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域上分布有多個(gè)酶活性位點(diǎn)，在其C端還有一個(gè)跨膜區(qū)，屬于不依賴于ATP的螯合酶Ⅱ超家族

5、成員，位于葉綠體區(qū)室中。在進(jìn)化上，AhFC1蛋白和黃瓜的鐵螯合酶1親緣關(guān)系最近。
　　(3)表達(dá)模式分析表明，干旱脅迫處理能夠迅速誘導(dǎo)AhFC1的表達(dá)量上升，6h后即可達(dá)到最大值，隨后開始緩慢降低。相對(duì)于干旱脅迫處理，鹽脅迫誘導(dǎo)的AhFC1呈緩慢上升趨勢(shì)，達(dá)到峰值所需的時(shí)間也相對(duì)延后，至12h才達(dá)到表達(dá)峰值，然后開始下降。
　　(4)鹽脅迫下，轉(zhuǎn)AhFC1基因煙草的萌發(fā)率顯著高于野生型煙草。雖然轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草葉片中的