三種溫控脫細(xì)胞載體的制備與性能評(píng)估.pdf

1、背景：生物人工肝的核心組成之一是細(xì)胞支架，支架材料需要有良好的生物相容性、三維多孔結(jié)構(gòu)、適宜的力學(xué)性能、良好的細(xì)胞親和性以及細(xì)胞可無(wú)損傷脫附等。設(shè)計(jì)、制備新型溫敏高分子三維細(xì)胞支架是目前高分子科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　目的：制備和構(gòu)建三種不同的溫控脫細(xì)胞載體，模擬細(xì)胞外基質(zhì)的功能，并評(píng)估其性能。
　　方法：分別制備共聚異丙基丙烯酰胺溫控脫細(xì)胞支架（PNA）、大孔共聚異丙基丙烯酰胺溫控脫細(xì)胞支架（PNAK）與大孔共聚異丙基丙烯

2、酰胺交聯(lián)醛基化海藻酸鈉溫控脫細(xì)胞支架（PNAKO），檢測(cè)三種支架的比表面積、溫敏性能、孔隙率、孔徑及細(xì)胞相容性。
　　結(jié)果與結(jié)論：1.利用 P(NIPAm-AAm)的溫敏特性，合成 PNA三維細(xì)胞支架；采用海藻酸鈉為致孔劑，將溫敏性 P(NIPAm-AAm)制成相互連通的多孔三維細(xì)胞支架 PNAK；通過(guò) Schiff反應(yīng)在 P(NIPAm-AAm)上交聯(lián)醛基化海藻酸鈉（OSA），并以海藻酸鈉為致孔劑，制成具有互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的多孔三維

3、細(xì)胞支架 PNAKO。2.通過(guò)對(duì)三種溫控脫細(xì)胞支架紅外光譜（IR）比較分析，證明P(NIPAm-AAm)與OSA發(fā)生了化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，PNIPA-AM上的-NHNH2和OSA上的-CHO反應(yīng)生成C=N鍵。3.三種溫控脫細(xì)胞支架比表面積（S）測(cè)定結(jié)果表明，PNA細(xì)胞支架由于沒(méi)有加入任何致孔劑，其比表面積只有135 m2/g；PNAK細(xì)胞支架由于內(nèi)部以海藻酸鈉為致孔劑形成多孔結(jié)構(gòu)，使其比表面積大大增加，達(dá)到386m2/g；PNAKO細(xì)胞支架由

4、于內(nèi)部不但以海藻酸鈉為致孔劑，而且交聯(lián)醛基化海藻酸鈉（OSA）形成互穿式網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使其比表面積達(dá)到421m2/g，可以印證PNAK和PNAKO比PNA具有更加明顯的孔洞結(jié)構(gòu)。4.三種溫控脫細(xì)胞支架掃描電鏡(SEM)檢測(cè)結(jié)果顯示，PNA溫控脫細(xì)胞支架具有不規(guī)則的孔結(jié)構(gòu)，PNAK溫控脫細(xì)胞支架具有規(guī)則相連貫穿的多孔和密集均勻的分布，這是由于加入致孔劑海藻酸鈉導(dǎo)致溫敏凝膠產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)。PNAKO溫控脫細(xì)胞支架具有互穿網(wǎng)狀的多孔結(jié)構(gòu)，孔洞密集且

5、分布均勻，相互貫穿相連，說(shuō)明將溫敏凝膠交聯(lián)醛基化海藻酸鈉，加入致孔劑海藻酸鈉導(dǎo)致溫敏凝膠產(chǎn)生互穿網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)。5.三種溫控脫細(xì)胞支架溫敏性能檢測(cè)表明，三種溫控脫細(xì)胞支架均具備溫度敏感特性，而且最低臨界溶解溫度LCST溫度相近。PNA的LCST約為30℃，PNAK的LCST約為28.5℃，PNAKO的LCST約為29.5℃。6.三種溫控脫細(xì)胞支架溶脹率(SR)測(cè)定結(jié)果提示，三種溫控脫細(xì)胞支架溶脹度能夠讓支架基本保持形狀，同時(shí)滿足細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的

6、獲得和代謝物質(zhì)傳輸。7.三種溫控脫細(xì)胞支架孔隙率和孔徑測(cè)定結(jié)果顯示，PNAK、PNAKO的孔隙率和孔徑明顯大于PNA，由于PNA孔結(jié)構(gòu)不規(guī)則，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示出平均值，因此作為細(xì)胞支架PNAK和PNAKO比PNA更具優(yōu)越性。8.三種溫控脫細(xì)胞支架的生物相容性評(píng)價(jià)結(jié)果證實(shí)， PNAKO支架由于交聯(lián)了醛基化海藻酸鈉降低了細(xì)胞毒性，生物相容性明顯優(yōu)于PNA和PNAK溫控脫細(xì)胞支架，PNAK相比PNA細(xì)胞毒性沒(méi)有明顯變化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出最佳三維細(xì)胞

7、支架 PNAKO，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究是以PNAKO為細(xì)胞培養(yǎng)支架。9.誘導(dǎo)后的肝樣細(xì)胞在三維溫控脫細(xì)胞支架PNAKO中培養(yǎng)28天，經(jīng)組織學(xué)切片顯示，細(xì)胞形態(tài)良好，生長(zhǎng)緊密，呈片狀分布在載體表面及孔隙中，說(shuō)明支架和細(xì)胞的相容性很好。10.利用 PNAKO支架溫度響應(yīng)性,對(duì)6批次誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后的D組細(xì)胞溫度誘導(dǎo)脫附行為測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)環(huán)境溫度降低時(shí), PNAKO支架收縮，細(xì)胞發(fā)生了自動(dòng)脫附。這種溫度誘導(dǎo)脫附方法可以避免酶解法對(duì)細(xì)胞造成的損傷,能