豬三種細(xì)胞因子克隆表達(dá)及山羊三種細(xì)胞因子免疫增強(qiáng)作用的研究.pdf

1、細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有廣泛生物學(xué)活性的異質(zhì)性肽類調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)能激活免疫活性細(xì)胞，對(duì)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)有重要作用。IL-2、IL-4和IFN-γ，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫、抵抗微生物感染、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能，對(duì)調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)有重要作用。本研究分別成功的構(gòu)建了山羊和豬的三種細(xì)胞因子的真核和原核重組質(zhì)粒，研究了山羊三種細(xì)胞因子對(duì)口蹄疫滅活苗的免疫增強(qiáng)作用。為以后篩選高效的細(xì)胞因子免疫佐劑奠定基礎(chǔ)。

2、r>　　1.豬IL-4和IFN-γ的基因克隆依據(jù)NCBI上豬IL-4的GenBank NM_214123.1登錄號(hào)，豬IFN-γGenBankNM213948.1登錄號(hào)，設(shè)計(jì)合成特異性引物，從刀豆素（ConA）刺激的豬外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出豬IL-4和IFN-γ基因序列，并采用軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。克隆得到的豬IL-4成熟序列321bp，編碼107個(gè)氨基酸;豬IFN-γ基因成熟序列432bp編碼144個(gè)

3、氨基酸與已公布的序列同源性分別為99.5％和100％。
　　2.豬三種細(xì)胞因子重組蛋白的表達(dá)及活性檢測(cè)構(gòu)建了豬三種細(xì)胞因子的原核表達(dá)載體，并成功的表達(dá)了重組蛋白。pET328a(+)-SIL-2的融合蛋白大小為21.4 KD，pET32a(+)-SIL-4融合蛋白為30.3 KD，pET28a(+)-SIFN-γ融合蛋白為18.4 KD。采用親和層析的方法對(duì)包涵體進(jìn)行純化，同時(shí)應(yīng)用梯度透析復(fù)性的方式對(duì)純化后的蛋白復(fù)性，獲得了高純度

4、的重組蛋白。采用MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示重組蛋白對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖作用的最佳濃度分別為4μg/mL、8μg/mL。在PK-15/VSV系統(tǒng)檢測(cè)IFN-γ的抗病毒活性，結(jié)果顯示在PK-15細(xì)胞上抑制VSV病毒復(fù)制的活性為2.70×103U/mg。
　　3.真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建通過(guò)將山羊和豬的IL-2、IL-4、IFN-γ基因分別與真核表達(dá)載體pVAX1.0連接，成功獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒免疫小鼠，采用RT-PCR和westen-b