銅綠假單胞菌與慶大霉素抗性相關(guān)的PA5471-PA5472基因間隔區(qū)調(diào)控功能研究.pdf

1、銅綠假單胞菌是一種重要的條件致病菌，在臨床上常常引起難治性和頑固性感染。隨著廣譜抗生素藥物的廣泛大量使用，該菌的多重耐藥現(xiàn)象和發(fā)生頻率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在銅綠假單胞菌基因組中，有一部分基因間隔區(qū)序列，雖然不能編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物，但能夠與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，或是具有啟動(dòng)子活性，通過(guò)近端或遠(yuǎn)端調(diào)控甚至參與到復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)而調(diào)節(jié)某些基因的功能。研究與耐藥性密切相關(guān)的基因間隔區(qū)調(diào)控功能，將作為另一個(gè)有效的突破口，對(duì)于解釋銅綠假單胞菌復(fù)雜的多重耐藥機(jī)制有重

2、要意義。
　　 本文以一株卡那霉素敏感的臨床分離株P(guān)A68為出發(fā)菌株，應(yīng)用人工Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)構(gòu)建突變文庫(kù)并從中篩選得到一株對(duì)慶大霉素抗性明顯增強(qiáng)的菌株C18。突變株通過(guò)基因克隆、核苷酸序列分析，確定在基因組上的Mu插入位點(diǎn)為PA5471-PA5472之間的基因間隔區(qū)。該基因間隔區(qū)的上下游基因PA5471和PA5472均屬Ⅳ類基因。
　　 通過(guò)生物信息學(xué)分析，該基因間隔區(qū)內(nèi)含有假定的啟動(dòng)子序列，因此構(gòu)建野生型和Mu插入突變型

3、基因間隔區(qū)的啟動(dòng)子-報(bào)告基因融合質(zhì)粒，并在銅綠假單胞菌PA68中進(jìn)行表達(dá)。報(bào)告基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶活性分析結(jié)果顯示，野生型和突變型的基因間隔區(qū)均有轉(zhuǎn)錄活性，并且Mu插入突變后該間隔區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)。
　　 本文首次利用Mu體外突變產(chǎn)生系統(tǒng)對(duì)具有啟動(dòng)活性的基因間隔區(qū)進(jìn)行功能研究，構(gòu)建了一系列的該間隔區(qū)序列的15 bp隨機(jī)插入庫(kù)，并對(duì)啟動(dòng)子.報(bào)告基因融合質(zhì)粒的β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行詳細(xì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該間隔區(qū)內(nèi)不同位置的序