銅綠假單胞菌中PA4857對Ⅲ型分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一種條件致病菌，能引起人體急性和慢性感染。急性感染主要與三型分泌系統(tǒng)(typeⅢsecretion system，T3SS)和運動能力有關(guān)，而慢性感染主要與六型分泌系統(tǒng)(typeⅥsecretion system，T6SS)和生物被膜有關(guān)。銅綠假單胞菌可以利用T3SS向宿主分泌毒性蛋白，逃避吞噬細胞的吞噬，引起宿主上皮細胞和巨噬細胞的損傷，破壞胞內(nèi)信號或者導(dǎo)致細胞死亡。

2、銅綠假單胞菌主要分泌4種毒性蛋白來發(fā)揮作用:包括胞外酶S(ExoS)，胞外酶T(ExoT)，胞外酶U(ExoU)以及胞外酶Y(ExoY)。目前，T3SS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究并不清楚，還有很多未知的調(diào)控因子沒有發(fā)現(xiàn)。本研究以銅綠假單胞菌的效應(yīng)蛋白ExoS作為突破點，通過構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變庫篩選對exoS的表達有調(diào)控的基因。將exoS的啟動子與lux報道子融合，整合至PAO1菌株中，并在此菌的基礎(chǔ)上構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變體庫。根據(jù)發(fā)光強弱的變化，結(jié)果共篩選到15

3、個影響exoS表達的基因，包括已知的exsA，pcrD和vqsM等，以及幾個未知功能的基因，如:PA5264，PA4857等。
　　本文對PA4857進行了重點研究(根據(jù)PA4857功能將其命名為tspR)。在PAO1中敲除掉tspR基因(AtspR)，發(fā)現(xiàn)效應(yīng)蛋白ExoS、生物被膜的形成量以及細胞毒性均降低，突變體對小鼠的致病能力也有所影響。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)tspR對調(diào)控RsmA的兩個小RNA:RsmY和RsmZ，均有負調(diào)控作

4、用。ExoS在兩個雙突變ΔtspRΔrsmY、ΔtspRΔrsmZ中的表達量以及生物被膜的形成量基本恢復(fù)到野生型水平。同時，在retS突變體中，T3SS的表達量和生物被膜的形成量可以通過過表達tspR而部分恢復(fù)到野生型水平。這說明RetS正調(diào)節(jié)tspR，而TspR通過調(diào)控兩個小RNA(RsmY/RsmZ)來調(diào)控T3SS。因此，本研究發(fā)現(xiàn)了一個與retS-gacS系統(tǒng)相協(xié)調(diào)的新的調(diào)控途徑:retS-tspR途徑。這些研究結(jié)果為進一步理解T