銅綠假單胞菌多重耐藥相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：了解銅綠假單胞菌多重耐藥性和相關(guān)機(jī)理。 方法：用Whonet軟件分析篩選臨床分離的多重耐藥菌株；E-test方法和EDTA紙片增強(qiáng)法對(duì)篩選出的多重耐藥株進(jìn)行金屬β-內(nèi)酰胺酶的表型篩選和PCR基因擴(kuò)增；多步誘導(dǎo)法對(duì)3株敏感株進(jìn)行體外藥物誘導(dǎo)耐藥試驗(yàn)，采用微量肉湯稀釋法測(cè)定加與不加外排泵抑制劑的誘導(dǎo)耐藥株和多重耐藥分離株的MIC值，篩選主動(dòng)外排表型陽(yáng)性菌株并進(jìn)行外排基因擴(kuò)增；RT-PCR檢測(cè)外膜蛋白OprM的mRNA表達(dá)水平；

2、對(duì)部分?jǐn)U增陽(yáng)性基因進(jìn)行測(cè)序分析。APB紙片增強(qiáng)法檢測(cè)Ampc酶表型陽(yáng)性菌株，按CLSI標(biāo)準(zhǔn)對(duì)多重耐藥株進(jìn)行ESBLs確認(rèn)試驗(yàn)，對(duì)AmpC酶表型陽(yáng)性菌株采用亞胺培南誘導(dǎo)+多底物相鄰紙片法進(jìn)行誘導(dǎo)性AmpC酶定性試驗(yàn)，PCR反應(yīng)檢測(cè)AmpC酶基因和ESBLs基因。 結(jié)果：用Whonet軟件篩選出我院2004年10月到2005年10B由不同患者臨床分離的850株銅綠假單胞菌中多重耐藥菌株70株，其中金屬β-內(nèi)酰胺酶表型篩選陽(yáng)性菌52株

3、，52株菌中PCR擴(kuò)增檢出imp和vim基因分別37株和3株，1株可疑spm陽(yáng)性；3株敏感株經(jīng)過體外藥物誘導(dǎo)試驗(yàn)均出現(xiàn)了穩(wěn)定性耐藥株，3株菌在誘導(dǎo)前后均擴(kuò)增出了外排基因；主動(dòng)外排表型70株多重耐藥菌株中陽(yáng)性菌株46株，其中檢moxB，oprM,mexR基因同時(shí)存在有42株，2株未檢測(cè)到外排基因；70株多重耐藥菌株通過PCR擴(kuò)增58株同時(shí)存在主動(dòng)外排基因mcxB,oprM,mexR基因，10株未檢測(cè)到MexAB-OprM外排基因；RT-P

4、CR產(chǎn)物測(cè)定OD值，1株誘導(dǎo)耐藥菌株和3株多重耐藥分離株外膜蛋白OprM的mRNA表達(dá)水平比PA01增高，經(jīng)測(cè)序與GenBank中U23763相比，2株同源性為100％，1株第434位核苷酸序列插入2bp(AT)堿基，1株誘導(dǎo)菌第222位核苷酸由C變?yōu)門，氨基酸序列均為L(zhǎng)EU，為無義突變，核苷酸序列第436位插入lbp(A)堿基；70株多重耐藥菌株中AmpC酶表型陽(yáng)性菌株51株，ESBL表型陽(yáng)性菌株1株(且與AmpC酶同時(shí)存在)，其中d

5、ha和tem基因分別檢測(cè)出1株，沒有檢測(cè)出shv,ctx基因；對(duì)51株AmpC酶表型陽(yáng)性菌株進(jìn)行誘導(dǎo)性AmpC酶定性試驗(yàn)陽(yáng)性者有33株，其中以頭孢噻肟(CTX)、哌拉西林(PIP)、氨曲南(ATM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA)、頭孢他啶(CAZ)為作用底物的菌株依次為4株、22株、24株、8株、2株、20株、10株，未檢測(cè)到誘導(dǎo)型產(chǎn)酶者有18株。70株菌中同時(shí)存在金屬β-內(nèi)