超聲靶向破壞微泡增強(qiáng)microRNA-21轉(zhuǎn)染豬心肌組織的研究.pdf

1、目的：超聲靶向破壞微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)作為一項(xiàng)高效、安全、具有靶向性的非病毒基因傳輸技術(shù)，已成功應(yīng)用于體外及小動(dòng)物研究。然而，UTMD介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染大動(dòng)物心肌組織的可行性、轉(zhuǎn)染條件及其效果如何，目前國內(nèi)外少有研究報(bào)道。本研究擬探討UTMD介導(dǎo)microRNA-21(miR-21)轉(zhuǎn)染豬心肌的可行性并進(jìn)一步優(yōu)化其轉(zhuǎn)染參數(shù)。
　　方法：構(gòu)建miR-2

2、1真核表達(dá)質(zhì)粒并體外轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞以檢測(cè)其表達(dá)活性。我們首先優(yōu)化UTMD介導(dǎo)miR-21轉(zhuǎn)染豬心肌組織的適宜輻照強(qiáng)度。經(jīng)耳緣靜脈給予載基因超聲微泡(miR-21/MB)，同時(shí)以不同超聲強(qiáng)度(1W/cm2，2W/cm2，3W/cm2)輻照左室前壁直至微泡消失。待研究得出適宜輻照強(qiáng)度后進(jìn)一步探討UTMD介導(dǎo)miR-21經(jīng)靜脈與冠脈轉(zhuǎn)染豬心肌組織的效果。分別經(jīng)耳緣靜脈及冠脈左前降支（LAD）給予miR-21/MB，同時(shí)經(jīng)胸進(jìn)行超聲輻照;以單

3、純PBS注射組（空白對(duì)照組）、單純靜脈或冠脈注射miR-21/MB而不予超聲輻照組作為對(duì)照。采用心臟超聲評(píng)價(jià)心功能，以電化學(xué)發(fā)光法(ELC)檢測(cè)血清肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)水平;術(shù)后4天取左室前壁心肌組織，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察心肌組織增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)情況，石蠟切片HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)心肌組織miR-21及其靶基因P

4、DCD4的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：miR-21重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并可在真核細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。應(yīng)用心臟超聲在術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(3h，12h，24h，4d)檢測(cè)心功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度超聲輻照(1W/cm2，2W/cm2，3W/cm2)各組心功能指標(biāo)(LVEF, FS，CO及LVEDd)均未見明顯動(dòng)態(tài)改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。血清cTnⅠ動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果顯示，3W/cm2超聲輻照組血清cTnⅠ水平呈動(dòng)態(tài)改變，術(shù)后3h開始升高，

5、12h達(dá)高峰，此后逐漸下降并于術(shù)后4d回到基線水平（P＜0.05）。1W/cm2及2W/cm2超聲輻照組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)血清cTnⅠ水平均未見明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HE染色結(jié)果顯示不同強(qiáng)度超聲輻照各組心肌組織形態(tài)保持完好，未見心肌壞死、出血以及炎癥反應(yīng)等。FQ-PCR結(jié)果表明與1W/cm2、3W/cm2超聲輻照組相比，2W/cm2超聲輻照心肌組織miR-21表達(dá)水平較高(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯

6、示與1W/cm2超聲輻照組相比，2W/cm2、3W/cm2超聲輻照均可顯著抑制心肌組織PDCD4表達(dá)，尤以2W/cm2超聲輻照組明顯(P＜0.05)。
　　UTMD介導(dǎo)miR-21經(jīng)靜脈與冠脈轉(zhuǎn)染豬心肌，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組心肌組織未見EGFP表達(dá);單純靜脈或冠脈給予miR-21/MB，EGFP表達(dá)主要位于心內(nèi)膜下及血管周圍;聯(lián)合超聲輻照后，心肌組織可見明顯EGFP表達(dá)。FQ-PCR結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，單純

7、靜脈給予miR-21/MB并不能提高心肌組織miR-21表達(dá)（P＞0.05），單純冠脈給予miR-21/MB雖可提高心肌組織miR-21表達(dá)，但轉(zhuǎn)染效率仍然較低(P＜0.05)。與單純給予miR-21/MB相比，不論靜脈抑或冠脈內(nèi)給藥，UTMD均可顯著提高心肌組織miR-21表達(dá)(P＜0.05)，其中冠脈給藥組稍高于靜脈給藥組，盡管其給藥劑量為靜脈組的一半(P＜0.05)。Western blot結(jié)果表明，單純靜脈給予miR-21/MB

8、不能抑制PDCD4表達(dá)(P＞0.05);單純冠脈給予miR-21/MB，心肌組織PDCD4表達(dá)稍有下降(P＜0.05);而UTMD介導(dǎo)miR-21經(jīng)靜脈或冠脈轉(zhuǎn)染豬心肌可顯著抑制PDCD4表達(dá)(P＜0.05)，尤以冠脈給藥組明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論：以強(qiáng)度2W/cm2，頻率1MHz，占空比50％，脈沖輻照20min，不論經(jīng)靜脈抑或冠脈途徑給藥，UTMD均可顯著增強(qiáng)外源基因轉(zhuǎn)染大動(dòng)物心肌組織?？紤]到臨床應(yīng)用的簡(jiǎn)便性、較小的侵