載基因陽離子脂質(zhì)超聲微泡制備及其體外增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分載基因陽離子超聲微泡的制備及其特性研究
　　目的：制備一種新型的陽離子脂質(zhì)超聲微泡造影劑，評(píng)價(jià)其載基因能力、理化特性及兔肝體內(nèi)增強(qiáng)顯像效果。
　　方法：采用薄膜分散、機(jī)械震蕩法，經(jīng)PEG修飾，脂膜材料中加入DC-膽固醇，制備陽離子超聲微泡；觀察其形態(tài)、粒徑、表面電位等物理特性，并考察平均粒徑、濃度及表面電位在一定條件下隨時(shí)間(6h、12h、24h、2d、7d、14d)變化情況；Nanodrop2000光度儀測(cè)定游離D

2、NA量，分析微泡載基因能力；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)微泡與DNA復(fù)合物能否抵抗核酸酶降解；評(píng)價(jià)兔肝內(nèi)顯影效果及對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)的毒性作用；并與普通脂質(zhì)微泡作對(duì)比。
　　結(jié)果：所制備的陽離子微泡形態(tài)規(guī)則，穩(wěn)定性好，馬爾文電位儀測(cè)得平均表面電位為(+29.02±1.30)mV，2周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)電位變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；2周內(nèi)平均粒徑變化范圍為(1201.

3、4±0.47)～(1405.3±0.25nm)，濃度變化范圍為(4.13±0.13)～(3.85±0.05)×108/ml。載基因量?jī)?yōu)化結(jié)果顯示最大基因結(jié)合效率為39.7％，最大基因結(jié)合量為4μg/108個(gè)微泡(microbubble，MB)。薄膜分散制備方法簡(jiǎn)單、可靠，且所制陽離子微泡對(duì)細(xì)胞毒性作用小，與DNA結(jié)合后能抗核酸酶降解，兔肝臟內(nèi)增強(qiáng)顯影持續(xù)時(shí)間超過15 min。
　　結(jié)論：自制的新型陽離子微泡是一種理想的超聲造影劑，

4、能顯著增加基因攜帶量并保護(hù)核酸免遭降解，可望提高UMMD增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率，成為基因投遞系統(tǒng)的優(yōu)化材料。
　　第二部分超聲聯(lián)合陽離子超聲微泡體外增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探索超聲破壞陽離子微泡增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的最佳聲學(xué)條件，探討其體外增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染HUVEC效果，與普通脂質(zhì)微泡及脂質(zhì)體2000作比較，評(píng)價(jià)其增強(qiáng)轉(zhuǎn)染同時(shí)對(duì)細(xì)胞活性影響。
　　方法：根據(jù)細(xì)胞存活情況篩選出最佳超聲強(qiáng)度和微泡濃度組合；將陽離子微泡、普通脂質(zhì)微泡、

5、脂質(zhì)體2000及質(zhì)粒DNA以不同的處理組加入培養(yǎng)的HUVEC，分為6組：
　?、賳渭冑|(zhì)粒組；
　?、谫|(zhì)粒+超聲輻照組；
　　③質(zhì)粒+陽離子微泡組；
　　④質(zhì)粒+普通脂質(zhì)微泡+超聲輻照組；
　?、葙|(zhì)粒+脂質(zhì)體組；
　?、拶|(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照組；比較各組轉(zhuǎn)染率。
　　同時(shí)探討(質(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照)組在不同微泡濃度下HUVEC轉(zhuǎn)染率與存活率關(guān)系，得出有效轉(zhuǎn)染的微泡濃度；增加HEK293細(xì)

6、胞在④⑤⑥三組中與HUVEC轉(zhuǎn)染率比較。應(yīng)用CKX41熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)，F(xiàn)ACS流式儀檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染率，MTT法分析細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果：聲能為0.5W/cm2，微泡濃度為3×108/ml時(shí)，細(xì)胞存活率輕度降低，超聲聯(lián)合陽離子微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染HUVEC效果明顯，較普通脂質(zhì)微泡顯著增強(qiáng)，與脂質(zhì)體2000相比未見明顯優(yōu)勢(shì)。各處理組對(duì)細(xì)胞存活率影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，單獨(dú)考察(質(zhì)粒+陽離子微泡+超聲輻照)組，微泡濃度